第八章基因工程

第八章基因工程第一节基因工程概述遗传工程广义：细胞工程、蛋白质工程、基因工程、酶工程、发酵工程狭义：基因工程→基因工程概述基因工程是20世纪70年代初随着DNA重组技术的发展应运而生的一门新技术。→1982年经美国食品及药物管理局批准，采用基因工程方法在细菌中表达生产的人的胰岛素进入市场，成为基因工程产品直接造福于人类的首例。→1985年转基因植物获得成功。→1996年克隆羊诞生。→现在，人类已利用这一技术改造和创建新的生命形态、生产药品、疫苗和食品，诊断和治疗遗传疾病。基因工程的基本步骤：1.目的基因的分离或合成。2.将目的基因与载体DNA连接，构建重组DNA分子-表达载体。3.将重组DNA分子导入受体细胞，并获得具有外源基因的个体。4.转基因生物的检测与鉴定。5.转基因生物的安全性评价。第二节基因的分离基因分离（克隆）包括3个步骤：1.目标DNA片段（基因）的分离；2.目标基因克隆到载体上；3.载体导入宿主细胞并在其中大量复制。一、工具酶1、限制性内切核酸酶限制酶：作用于特定（异）核苷酸序列的磷酸二脂酶。Ⅰ型酶：仅EcoB和EcoK两种，催化限制性切割和修饰核苷酸2种功能。Ⅱ型酶：基因工程中应用最广泛。Ⅲ型酶：具有特异的识别位点，识别位点是非对称的。Ⅱ型限制性酶的基本特性：①有特异识别和切割的序列部位；②DNA分子上两个单链断裂的部位通常不是直接相对的；③断裂所形成的DNA片段常具有碱基互补的单链尾巴（粘性末端）；限制性内切酶EcoRI的酶切位点及酶切产物连接GCTTAA5´3´GAATTCCTTAAG5´3´3´5´GAATTCCTTAAG5´3´3´5´AATTCG5´3´AATTCTTAAG5´3´GC5´3´ab回纹序列图12-1通过用相同的限制性内切酶切割形成一个重组DNA分子限制性内切酶SmaI的识别及酶切位点CCCGGGGGGCCC5CCCGGGGGGCCC,3,3,,5,5,5平齐末端2、DNA连接酶DNA连接酶：重组DNA分子构建必不可少的工具酶，能催化DNA中相邻的3’–OH和5’–磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA连接起来。3、反转录酶一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚合酶，故又称依赖于RNA的DNA聚合酶。4、聚合酶链式反应(PCR)PCR是体外快速扩增DNA的方法,由美国的Mullis(1986)发明,1993年诺贝尔化学奖。PCR可对特定DNA片段进行扩增，且可用痕量DNA作模板，对DNA纯度要求也不高,可在几小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝。PCR反应从启动到结束称为一个循环，每个循环包括三个步骤：1）变性：95℃，DNA双链分离成单链。2）退火(复性)：55℃左右，引物与单链的模板DNA序列互补结合。3）延伸：72℃左右，Taq酶通过在引物的3’-OH端增加碱基的办法使引物延伸。表12-2PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系循环数PCR产物拷贝数12125253210210102415215327682022010485762522533554432302301073741824二、载体载体：将外源基因送入受体细胞的工具。载体类型：细菌质粒、噬菌体或病毒、细菌/酵母菌人工染色体BAC、YAC等。载体特点：①在宿主细胞中能独立复制，即本身为复制子，有独立的复制起始位点。②有限制酶切位点，允许外源基因插入且插入后随载体DNA分子一同进行复制或扩增。③有选择标记，便于选择含重组DNA分子的寄主细胞。④分子量小，多拷贝，易于操作。⑤载荷外源DNA的大小范围要宽，安全。（1）细菌质粒：广泛应用于基因工程图12-6质粒pUC18的结构及多克隆位点（2）噬菌体载体1、噬菌体；2、噬菌体DNA；3、噬菌体DNA中间基因簇；4、将连接物体外包装后感染细菌，制备基因库（用于基因库构建）246135（3）克隆大片段DNA的载体黏粒载体：含有cos位点的质粒载体，兼有λ噬菌体的高效感染能力和质粒的易于克隆和选择的优点。克隆外源片段的长度在15-45kb之间。细菌人工染色体（BAC）上述的几种载体都不能携带大于50kb的外源DNA片段，而很多真核生物基因长度在50kb以上。细菌人工染色体载体就是为克隆更大的外源DNA片段而设计构建的基于F因子的人工载体。图12-9细菌人工染色体载体pBAC108L及其多克隆位点。可插入达300kb左右的DNA片段。酵母人工染色体（YAC）YAC载体是基于酵母染色体结构设计的，可以插入大片段的DNA（1-2Mb），成为人类基因组计划（HGP）的一种重要工具。三、基因分离方法一个基因就是编码一条多肽链的一个DNA片段。包括：启动子、终止子、内含子等。1、基于文库的基因分离方法基因文库(library)：是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体。从基因文库中分离基因的流程为：（1）构建基因文库基因组文库：使用与切割质粒相同的限制性内切酶，将供体生物体的基因组DNA切成许多片段，然后将其连接到载体上构成的一个重组DNA群体cDNA文库：以mRNA为模板，在反转录酶作用下，合成cDNA，将其与适当载体连接并转化到宿主细胞内进行扩增构建成的基因库。（2）筛选基因库利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或寡核苷酸)作探针(probe)，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。图12-10菌落杂交技术（3）阳性克隆的分析与鉴定从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能得到目的基因序列测定、生物信息分析、功能预测、功能鉴定。2、T-DNA标签克隆基因利用T-DNA插入突变创造突变体，获取目标基因或克隆。T-DNA载体构建转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子筛选T2，获突变子，应为3:1分离确定T-DNA与突变型共分离的个体产生纯合后代克隆T-DNA两侧的植物DNA利用侧翼DNA序列作探针从cDNA文库中钓取基因基因功能的验证（遗传互补测验，分离的野生基因转化突变体，回复功能）图12-11T-DNA标签克隆基因的基本原理3、基于PCR的基因克隆原理：根据待扩增基因的序列合成引物，使两个引物序列之间的基因序列获得大量扩增，产生大量的基因拷贝用于研究。4、基因的人工合成对于已知核苷酸序列、分子量较小的基因可以通过化学合成法制备基因。一般先一段一段地合成，然后将这些小片段连接起来。人工合成基因可以由DNA自动合成仪来完成。第三节外源基因的导入一、重组DNA技术重组DNA：指利用不同生物来源的DNA分子拼接的杂种DNA分子，是自然界中不存在的DNA分子。重组DNA技术主要步骤：1)从细胞或组织获得DNA并纯化；2)用限制酶切割DNA；3)将所得限制片段连接到载体上,形成重组DNA分子；4)重组DNA导入宿主细胞，在宿主细胞内复制，产生大量相同拷贝的重组DNA分子--克隆。5)克隆的DNA分子可以从宿主细胞中回收，纯化；6)克隆的DNA可以转录和翻译，其产品可以被分离出来用于研究或商业开发。重组DNA分子二、植物遗传转化方法1、农杆菌介导法（1）根癌农杆菌(Ti质粒)（2）发根农杆菌(Ri质粒)Ti质粒及其衍生载体Ti质粒包括五个区域：1.LB与RB之间的T-DNA，这段序列整合到植物基因组中；2.质粒转移区(PT)；3.冠瘿碱代谢区；4.复制原点；5.毒性区(Vir)。→T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。→Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。Ti质粒是约150-200kb的环状DNA分子，很难直接使用，故需对其加以改造，构建出Ti质粒的衍生载体系统，广泛用作植物基因工程中的载体：（1）双元载体(binaryvectors）如pBin19载体，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作为细菌选择标记，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作为植物的选择标记，pUC19的多克隆位点及α-互补显色标记（2）共整合载体(integratedvectors)图12-15棉花转基因植株生产过程F1.共培养2.在选择培养基上筛选3.筛选获得的抗性愈伤5.胚萌发成苗6.转基因植株移栽大田4.抗性愈伤分化成胚状体2、基因枪法基因枪法\生物弹法\微粒枪法\微粒轰击法—金、钨依赖高速的金属微粒将外源基因导入活细胞的一种转化技术。优点：无宿主限制，可以对任何基因型材料进行转化研究第四节转基因生物的检测与鉴定一、分子检测PCR：假阳性与假阴性Southernblot：转基因的完整性和拷贝数Northernblot：mRNAWesternblot：蛋白质二、性状鉴定M123456789第五节基因工程的应用及安全性评价一、基因工程的应用1、转基因植物抗除草剂、抗虫、抗病、抗逆的优良品系或品种，很多已经大面积种植推广。2008年1.25亿公顷：大豆、玉米、棉花、水稻、马铃薯、番茄等2、转基因动物：羊、牛3、基因工程工业生产胰岛素等lacZBchainBBBAAPlacZAchainABA12345PAB在细菌中产生胰岛素的方法4、遗传疾病诊断RFLP法（镰刀性贫血病）3’5’GTG3’5’GAG123IIIprobeAS5、基因治疗利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到具有遗传缺陷的患者的基因组中，以治疗遗传疾病。gagpolenvSV40hADALTR5,LTR5,neorLTR3,LTR3,AB基因治疗的载体和重组DNA分子6、环境保护生物修复，指利用生物吸收、降解、转化环境中的污染物，使污染物的浓度降低到可接受的水平，或将有毒有害的污染物转化为无害的物质，也包括将污染物稳定化，以减少其向周边环境的扩散。一般分为植物修复、动物修复和微生物修复三种类型。根据生物修复的污染物种类，它可分为有机污染生物修复和重金属污染的生物修复和放射性物质的生物修复等。狭义的生物修复，是指通过微生物的作用清除土壤和水体中的污染物，或是使污染物无害化的过程。二、安全性评价1、外源基因的毒性；2、人体免疫系统潜在过敏反应问题；3、抗生素抗性风险问题；4、“超级杂草”及生物多样性；5、转基因食品的安全性。