超级细菌给我们的警示,中儿2010-12

1﹒专论﹒超级细菌给我们的警示陆权“超级细菌”（Superbug）──一个形象地比喻细菌泛耐药的代名词，原本是临床医学和微生物学界关注和研究的项目，近3～４个月间在全球传媒上被报道得沸沸扬扬，由此产生的各种观点和声音，足以使我国儿科工作者去正视和了解，本文就此谈点自己的看法。一、事情的由来2010年8月11日《柳叶刀感染病学》（LancetInfectDis）杂志在线发表了Kumarasamy等一篇题名为“在印度、巴基斯坦和英国，一种新的抗生素耐药机制的出现：其分子学、生物学和流行病学的研究”的文章[1]。文中提到了一种带有新德里金属-β-内酰胺酶1（NewDelhimetallo-β-lactamase1，NDM-1）基因的、耐碳青霉素烯类抗生素的革兰阴性肠杆菌科细菌，其潜在性地可能成为全球公共健康问题。该文研究对象的180株菌株分别来自南印度Chennai市（44株），北印度Haryana市（26株）和英国（37株），其中印度两城市菌株为2009年度分离所得，英国菌株为2008～2009年度，取自英国抗生素耐药监测和参考实验室，原始来源于英国25个实验室，包涵了英格兰、苏格兰和北爱尔兰地区。此外，该研究还包括48株来自印度Mumbai等3所城市的菌株和25株采自巴基斯坦Charsadda等8所城市的菌株。涉及携带NDM-1基因的主要细菌有肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、变形杆菌、不动杆菌属、弗劳地枸橼酸菌、摩氏摩根菌和普鲁威登菌等。携带NDM-1基因的细菌在体外药敏试验中，对所有β内酰胺类及其酶抑制剂复合制剂、单环类抗生素、氨基糖苷类、四环素类、氟喹诺酮类等均高度耐药，尤其对亚胺培南、美洛培南的敏感率仅0－3%。唯一敏感的抗菌药物是粘菌素（colistin）和替加环素（tigecycline），前者敏感率约89%－100%，后者56%－67%。虽然携带NDM-1基因的细菌引起全球关注是在2010年，但在2009年Yong等[2]对携带该基因的1株肺炎克雷伯菌（Kp-05-506）已作了详尽的分子生物学作者单位：200040上海交通大学附属儿童医院呼吸科（Email：[e-mail]）2研究。该菌株来自1位59岁男性印度裔瑞典患者尿液培养中，该患者生活在瑞典，但经常往返印度，患有Ⅱ型糖尿病。2007年12月因臀部巨大脓肿而在印度新德里住院，而后又发生褥疮溃疡。2008年1月8日其回到瑞典，1月9日从尿培养中分离得到Kp-05-506菌株，该菌株对碳青霉烯类等抗菌药物耐药，当时患者并无尿路感染症状，尿菌落计数1000CFU/ml。同时，该患者臀部伤口深处还分离到产超广谱β内酰胺酶（ESBL）的大肠杆菌以及对碳青霉烯类抗生素敏感的不动杆菌，并从其外耳道分离到ESBL阳性的大肠杆菌。2008年3月6日该病人出院，2008年4月1日再取尿培养，分离出ESBL阳性的肺炎克雷伯菌，而原先对碳青霉烯类抗菌药物耐药的Kp-05-506菌株再也没有从该患者任何标本中分离出。Kumarasamy等的论文在讨论中提到了中国，认为虽然在中国抗生素耐药已被高度关注[3]，但blaNDM-1的迅速出现同样应引起中国注意。2010年8月13日，中国中央电视台新闻联播中称“超级细菌正在向全球蔓延”，各种传媒也敏锐地捕捉信息予以报道。同时，卫生部、中华医学会、中国医师协会、中国疾病控制预防中心（CDC）、部分国内专家等均纷纷表述观点和建议对策，“超级细菌”的凸显使医务人员警觉，也使社会公众困惑，难道我们真的面临无所适从的窘地？2008年10月26日中国CDC宣称，我国已检出3株NDM-1阳性的细菌，其中2株为屎肠球菌，由宁夏CDC送检，菌株采自2010年3月该地某县级医院2例低出生体重的新生儿；另1例由中国军事医学科学院实验室所分离的鲍曼不动杆菌，采自2010年6月福建某医院1位83岁的老人。这一报道说明携带NDM-基因的细菌在我国也客观存在，而中国CDC分离的革兰阳性菌──屎肠球菌携带该基因乃是全世界首次报告，且发生在新生儿，这在儿科界是一件值得关注的事。二、NDM-1的分子结构和特性Yong等[2]对携带NDM-1基因的耐碳青霉烯类抗生素的Kp-05-506菌株作金属酶表型和分子学检测，该菌株对所有β内酰胺类抗生素包括亚胺培南、美洛培南、厄他培南均耐药，唯一对粘菌素敏感，表型确认为产金属β内酰胺酶（MBL），但PCR扩增分析，该金属酶与已知的作为对照的blaVIM、blaIMP、blaSPM-1、blaSIM-1和blaATM-1型均不同源，属于一种全新的基因型，根据其可能的来源，称之为新德里金属β内酰胺酶-1（blaNDM-1）。Kp-05-506菌株的严重泛耐药性3通过基因分型和氨基酸测序得以明确有3处耐药相关区域。证据提示该菌存在2种不同的β内酰胺类耐药机制：第一种由AmpC酶介导，基于其在体外对EDTA耐药，但对氯唑西林敏感，此耐药基因位于2.1Kb片段中。其携带blaCMY-4基因，呈AmpC表型，其上游为一完整的ISEcP1基因拷贝，可能负责与blaCMY-4的转座和移动，其下游则为blc基因，通常与blaCMY伴存，最早由Kang等所报道[4]。第二种则为MBL酶介导，因其在体外对氯唑西林和克拉维酸耐药，但对EDTA敏感，其位于4.3Kb片段中。此MBL基因就是全新基因blaNDM-1，呈一嵌合体（chimera）位于肺炎克雷伯菌染色体DNA（Kpc-DNA）与Is26和Tn3转座基因的插入部分之间。Kpc-DNA由外流蛋白基因（effluxpump）、L-乳酸脱氢酶（ldh）标记的基因组成，这两者与已报道的肺炎克雷伯菌株MGH78578的染色体DNA有99.5%同源性（基因库编号CP000647）。该菌株的泛耐药还与其分子结构中含有其他耐药基因有关，已经明确：在其4.8Kb片段中尚含有Ⅰ类整合子（class1integron），其包含一套独特的基因，其中有些基因先前在亚洲已有报告，例如紧邻Int1基因的是arr2基因盒，介导对利福平耐药，其先前在中国大陆的铜绿假单胞菌和香港地区的鲍曼不动杆菌中被发现（基因库编号分别是EU886979和AY038837）。另一个ereC基因是全新的红霉素酯化酶基因，其92%核苷酸序列与原先的ereA相同，但其在N末端有额外的10个氨基酸，在整个序列中有31个氨基酸被替换。紧邻ereC基因的是介导对庆大霉素耐药的aadA1基因以及介导对氯霉素耐药的cmlA7基因盒，其存在于基因aadA1与qac/sul之间。NDM-1的结构特性：blaNDM-1基因推断有269个氨基酸，分子量约为275KDa，通过凝胶电泳和质谱仪分析提示其可作为一个单体而活化存在，HDM-1具有一个前导多肽，可能的裂解区是在19号位点2个丙氨酸之间，这与已知的VIMMBLs的裂解区十分相似。NDM-1也分享了VIM酶在第34和36位点上的附加环，还在第162至166位点上，具有独一无二的附加序列。从该结构可以看出NDM-1与其他金属酶极少同源性，与之最相近的是VIM-1/VIM-2，两者同源性也仅32.4%。奇妙的是NDM-1在移动的MBLs间尚有一组独一无二的HXHXD图谱：在2个组氨酸之间，插入1个丙氨酸。此外，NDM-1在第222位点上的色氨酸为酪氨酸所替代。blaNDM-1基因理论上的等电点（PI）是6.9。NDM-1的功能特性：通过凝胶电泳分析并与IMP-1、VIM-2比较，动力值4（KineticValues）显示：NDM-1对大多数头孢菌素有紧密联接，Km值较低，尤其对头孢呋辛、头孢噻肟和头孢噻吩，对青霉素类也有相对较紧密的联接，这与其他金属β内酰胺酶不同，例如IMP-1和VIM-2均具有较高的Km值。对于碳青霉烯类抗生素，NDM-1并未像IMP-1或VIM-2如此紧密联接。NDM-1的青霉素类抗生素转化率（Kcat）低于IMP-1和VIM-2，对头孢菌素类抗生素Kcat值与IMP-1更相似，而对碳青霉烯类抗生素的Kcat值则相近于VIM-2。由于NDM-1对大部分头孢菌素和碳青霉烯类抗生素的Km值较低，故Kcat/Km比值就相对较VIM-2高，唯一例外的是头孢他啶，NDM-1对其的Kcat/Km为-0.03，而VIM-2达0.90。总之，NDM-1与IMP-1、VIM-2相比对现有各类抗菌药物包括碳青霉烯类抗生素均有更强的水解能力。NDM-1的质粒分析：携带blaNDM-1质粒的肺炎克雷伯菌Kp-05-506可成功地将该质粒转移到大肠埃希菌J53，转移频率约为10-4-10-5。blaNDM-1质粒大小在Kp-05-506菌株为180Kb，而在大肠埃希菌，NDM-1质粒较小，约为140Kb。不同细菌携带blaNDM-1基因的质粒大小不一，这说明该基因在复制或插入时存在有再排列。质粒携带blaNDM-1同时还携带blaCMY-4和Ⅰ类整合子复合体，造成多重耐药，甚至出现对现存所有抗菌药物均耐药的可怕情景。通过质粒，NDM-1基因可以在不同细菌间转移，这就造成该基因可为临床上多种细菌所携带，造成不可预见性、高度耐药性和治疗困难性的严峻问题。日本新泻大学学者用电子显微镜成功拍摄了携带NDM-1基因的大肠埃希菌图像，这是全球首张所谓“超级细菌”的照片。该菌长约2微米，与普通大肠杆菌相比，超级细菌的鞭毛数多，故更具活动度和灵活性。三、警示与对策准确地讲，医学上并不存在所谓的“超级细菌”。上述的关于blaNDM-1的结构、功能特性和质粒分析等，可以清楚地看出Yong等是发现了一种全新的金属β内酰胺酶，这种酶主要存在革兰阴性肠杆菌，尤其是肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，此外还可以存在于阴沟肠杆菌、变形杆菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌、弗劳地枸橼酸菌等，我国报道尚存在于屎肠球菌之中。blaNDM-1基因可为多种细菌所共有，可以通过质粒在不同细菌间转移，这就构成防治的困难。目前，在印度、巴基斯坦、英国、美国、加拿大、日本、韩国、澳大利亚、比利时、瑞典、荷兰、5法国、德国、肯尼亚、中国大陆、中国香港、中国台湾等均已有感染或携带病例的报告，这就提示携带NDM-1基因的泛耐药细菌是一个全球性问题。现在资料揭示肠杆菌科细菌检出NDM-基因的比例为1.2%～13%。如果进一步加强监测，尤其是主动监测，或许还会有更多国家发现该基因、还会有更多临床分离的细菌携带该基因。“超级细菌”更确切地应称为泛耐药细菌。事实上，我国在全国耐药监测CHINET报告中，从2007年始已关注泛耐药这一问题[5-７]，所谓泛耐药是指该细菌对头孢菌素类、碳青霉烯类、β内酰胺酶抑制剂复合剂型、氨基糖苷类和氟喹诺酮类抗菌药物均耐药，2007年资料中泛耐药菌株在弗劳地枸橼酸菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌中所占的平均比例分别是5.9%、3.2%、2.8%和0.3%，2008年分别是4.1%、2.1%、10.9%和0.6%，2009年则为2.7%、1.7%、17.0%和1.8%。显然，中国泛耐药的鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌在明显增多，尤其是前者，这些细菌对碳青霉烯类抗生素均耐药，而耐药机制呈多重而复杂［8,9］。CHINET资料中，儿童患者泛耐药细菌的比例较低，2007年铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌的泛耐药分别是0.7%和2.2%，而在2008年为0.0%，但资料仅涵盖上海2所专科儿童医院，尚不能反映我国儿童泛耐药菌的全貌。“超级细菌”的出现又一次为我们敲响细菌泛耐药的警钟，切不可松懈和怠慢。从现有资料看，NDM-1细菌主要在医院内，可能通过密切接触而传染，通过手和污染医疗器械或其他物品传播，而非空气传播，通常不会在社区、普通健康人群中传播。NDM-1细菌传播存在有某些高危因素，例如危重病人、ICU病人、长期使用抗菌药物者、气管插管机械通气者、中心静脉留置导管者等。理论上，免疫功能低下者、早产儿、低出生体重儿也可能是易感人群。已知的NDM-1细菌主要引起尿路感染、血流感染、伤口感染、肺部感染和导管相关感染等，但其他部位不等于不会被感染，因