第八章蛋白质工程

第八章蛋白质工程湖南师范大学生命科学学院袁婺洲本章目录蛋白质工程的理论基础蛋白质工程的理论基础蛋白质结构测定与结构预测蛋白质工程的关键技术定点突变定向进化其他技术蛋白质工程的应用及实例定点突变与蛋白质药物工程：胰岛素定点突变、定向进化与工业用酶：枯草杆菌蛋白酶等结构域的拼接与金属硫蛋白工程抗体工程第一节蛋白质工程的理论基础蛋白质工程的概念蛋白质的结构蛋白质结构预测一蛋白质工程的概念基于对蛋白质结构和功能的认识，进行分子设计，通过基因工程途径定向地改造蛋白质或创造合乎人类需要的新的突变蛋白质的理论或实践活动。（1）确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系；（2）通过定点突变、定向进化等技术，合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质。二蛋白质的结构一级结构：多肽链的氨基酸残基的排列顺序二级结构：多肽链借助于氢键或离子键沿一维方向排列成具有周期性结构的图象。三级结构：指整个蛋白质多肽链在二级结构的基础上，侧链基团通过次级键或疏水键的相互作用进一步盘曲折叠，形成具有一定规则的空间结构。四级结构：由两条以上的多肽链组成的蛋白质，多肽链之间没有共价键连接而是借疏水作用等次级键缔合在一起形成的高级空间结构。氨基酸的聚合形成肽链肽链的空间结构单元:二硫键的折叠肽链的空间结构单元:氢键的折叠肽链的空间结构单元:离子键的折叠肽链的空间结构单元每四个氨基酸残基间的氢键构成多肽链a螺旋肽链的空间结构单元由不同多肽链上氨基酸残基间的氢键构成多肽链b折叠肽链的完整空间构象蛋白质结构与功能的关系蛋白质一级结构是空间结构的基础，而空间结构决定了蛋白质的功能。结构域：蛋白质多肽链上一段在三维结构上可以明显区分和相对独立并具有一定生物学功能的基本单位。模体（基序）：组成结构域的基本二级结构单位蛋白质的加工修饰:磷酸化修饰蛋白质的加工修饰:羧基化修饰几种参与凝血的蛋白因子（如VIII和IV因子）需要在其谷酰胺侧链上的g-羧基化修饰后，才能拥有蛋白酶的活性，这一修饰过程依赖与维生素K的存在。蛋白质的加工修饰:甲基化修饰肌肉中的一些蛋白质以及细胞色素C中的Lys会受到单甲基和二甲基化修饰；钙调蛋白会受到三甲基化修饰；所有C末端以Glu结尾的蛋白质，其Glu会受到甲基化修饰。蛋白质的加工修饰:N-糖基化O-糖基化糖基化修饰蛋白质的加工修饰:其它类型的修饰三蛋白质的结构预测一级结构：测序仪与数据库高级结构预测：X射线晶体衍射法核磁共振法（NMR）蛋白质一级序列数据库PIR：由国家生物医学研究基金会（NBRF）建立MIPS：Martinsried的蛋白质序列研究所收集和处理的蛋白质序列数据SWISS-PROT：蛋白质序列数据库，由Geneva大学和EMBL共同合作开发TrEMBL：翻译的EMBLNRL-3D：除序列信息外，也包括对二级结构，活性位点，结合位点和修饰位点等信息。第二节蛋白质工程关键技术定点突变定向进化其他技术一定点突变寡核苷酸引物介导的定点突变PCR介导的定点突变盒式突变遗传信息传递的中心法则DNA（基因）DNA（基因）mRNA蛋白质生物代谢物质复制转录翻译代谢基因组学转录组学蛋白组学代谢组学逆转录中心法则1.寡核苷酸引物介导的定点突变用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制的过程寡核苷酸引物介导的定点突变的Kunkel改进：载体：RF－M13DNA载体菌株：dUTP酶和N－尿嘧啶脱核苷酶双缺陷的菌株。原理：dUTP酶缺陷导致胞内dUTP上升，部分取代dTTP进入新生DNA链中，使得M13单链DNA大约1％的T被U取代。另一链合成后，将双链DNA导入正常大肠杆菌，N－尿嘧啶糖基化酶除去DNA链上的尿嘧啶碱基，原M13模板链被降解，突变链因不含U被保留下来。2.PCR介导的定点突变3.盒式突变利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。突变的寡核苷酸链成对存在，不会出现异源双链的情况。全部转化质粒都是突变体。二、定向进化先随机突变，再定向选择。如在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq酶不具有3－5端纠错的功能，配合适当条件，以很低的比率向目的基因引入突变，构建突变序列库，再凭借定向的选择方法，定向选出所需性质的突变酶。1.易错PCR在PCR反应中，降低一种dNTP的含量，使PCR容易出错，达到随机突变的目的。2.DNA改组用DNAaseI先将一个DNA片段消化成许多小片段，然后不加引物进行PCR，使得消化后DNA小段之间重新按多种组合方式连接重组，然后利用原来整片段DNA两端的引物进行加引物的PCR扩增，以便得到一系列改组后的突变DNA序列。3.体外随机引发重组以单链DNA为模板，随机引物扩增，将产生大量与模板不同位点互补的短的DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中会存在一些点突变。第三节蛋白质工程的应用实例胰岛素枯草杆菌蛋白酶金属硫蛋白抗体1.胰岛素的结构及其生物合成SSSSCNSSB肽（30）C肽（31）A肽（21）RRRKSSSSCNSSNC高尔基体内的特异性肽酶NCB肽C肽A肽信号肽酶信号肽胰岛素的改建工程速效胰岛素：SerB9Asp/ThrB27Glu，有利于降低胰岛素的缔合作用，进入血液的吸收率比天然胰岛素提高了3倍。长效胰岛素：AsnA21Gly/ThrB27Arg/ThrB30Thr酰胺，半衰期最长，达到35.5小时。高效胰岛素：HisB10Asp,活力是天然胰岛素的11.7倍。抗体抗体是一类免疫球蛋白IgG基本结构重链（heavychain，H）轻链（lightchain，L）可变区（variableregion,V区）恒定区（constantregion,C区）骨架区（frameworkregion,FR）铰链区（hingeregion）抗体的改造单克隆抗体多来自小鼠，使人产生抗鼠蛋白抗体将小鼠Ig的V区与人Ig的C区基因拼接，在人工体系中表达，产生人－鼠嵌合抗体。