第十七章基因工程和蛋白质工程

第十七章基因工程和蛋白质工程第一节基因工程的概念一、基因工程的含义基因工程，又称基因操作，ＤＮＡ重组技术，基因克隆，分子克隆等。克隆就是来自同一祖先的相同副本或拷贝的集合，而获得同一拷贝的过程则称为克隆化，也就是无性繁殖。重组是指不同来源的ＤＮＡ分子通过末端共价连接而形成重新组合的ＤＮＡ分子，这种分子可以保留不同来源ＤＮＡ的遗传信息。二、限制酶目的基因：在基因操作过程中，必须首先获得的所需要的基因。主要有两个来源：一是从已有的生物基因组中分离；二是用反转录酶合成cＤＮＡ。限制酶：是限制性内切核酸酶，是一类水解双链ＤＮＡ的磷酸二酯酶。（一）、限制酶的命名限制酶的名称用３个英文字母表示，第一个字母（大写）代表该酶的细菌属名，后两个字母（小写）代表种名。（二）、限制酶的分类根据酶的结构，断裂方式，分子大小及所需辅因子的不同，将限制酶分为三种类型。第一类含有三种不同亚基，对ＤＮＡ有专一识别序列，有限制和修饰两种酶活性。第二类酶对ＤＮＡ有恒定的专一识别及切割位点。第三类酶具有限制和修饰活性，有专一识别序列。（三）、限制酶的识别及切割位点三、基因载体基因载体的条件；一、能自主复制或随受体细胞染色体ＤＮＡ一起复制。二、易于鉴定和筛选。三、限制酶对其作用的切割点少。四、易与引入受体细胞。质粒是细菌染色体外的小型环状双链ＤＮＡ。噬菌体和病毒噬菌体是感染细菌的病毒。感染有两种方式，一种称为溶源性，另一种称为溶菌性。第二节基因工程的基本步骤一、目的基因的获得目的基因是指所要研究或应用的基因，或为了某种目的而感兴趣的ＤＮＡ片段。（一）ＤＮＡ文库包括基因组文库和cＤＮＡ文库（二）获取目的基因的方法１、ＤＮＡ片段直接提取２、从基因组文库和cＤＮＡ文库获取３、用ＰＣＲ技术扩增目的基因４、用化学合成目的基因二、外源ＤＮＡ与载体连接用连接酶将外源ＤＮＡ与载体ＤＮＡ通过共价连接，形成重组体。三、重组ＤＮＡ导入宿主细胞转化：指质粒或其他外源ＤＮＡ导入处于感受态的细菌细胞，并使其获得新的表型的过程。转导：指感受细菌细胞捕获和表达噬菌体和病毒ＤＮＡ分子的过程。转染：是真核细胞主动或被动导入外源ＤＮＡ片段而获得新的表型的过程。四、重组体的筛选1.插入失活法2.核酸杂交法3.免疫测定法4.ＰＣＲ扩增法五、克隆基因的表达第三节蛋白质工程一、蛋白质工程的概念蛋白质工程是研究蛋白质的结构及结构与功能的关系，然后人为地设计一个新蛋白质，并按这个设计的蛋白质结构去改变其基因结构，从而产生新的蛋白质。或者从蛋白质结构与功能的关系出发，定向地改造天然蛋白质的结构，特别是对功能基因的修饰，也可以制造新型的蛋白质。(一）、基因定点突变是指将基因的某一个或某些位点进行人工替换或删除的过程。（二）、蛋白质设计依赖于蛋白质结构测定和分子模型的建立，，按照蛋白质构效关系的理论基础，设计出比天然蛋白质性能优越的新型蛋白质。二、蛋白质工程的一般技术（一）、蛋白质工程的理论设计活性设计：考虑被研究的蛋白质的功能，涉及选择化学基团及其空间取向。专一性设计：指功能性蛋白质在发挥其生理功能的时，总是与其他分子发生专一性相互作用。框架设计：是指对蛋白质分子的立体设计。（二）、定点突变技术通过删除或置换DNA片段中的核苷酸，使基因发生改变，从而产生新的蛋白质。改变DNA核苷酸序列的几种方法：1.基因的化学合成2.基因直接修饰法3.盒式突变技术三、蛋白质工程的应用示例（一）、蛋白质工程酶1.改变酶的催化活性2.改变酶的底物专一性3.提高酶的稳定性4.改变酶的反应特性5.产生新酶（二）、药物研制1.B-干扰素2.白细胞介素23.胰岛素尽管蛋白质工程的发展历史很短，但由于它在理论上对生命科学发展的贡献，以及商业上可能带来的巨大价值，使得它的发展异军突起，迅猛异常。总之，由于蛋白质工程能按人的意愿定向地改造蛋白质和酶，必然有着无限广阔的发展前景。