第十五章基因工程和蛋白质工程简介

生物化学：第十五章基因工程和蛋白质工程简介华中师范大学生命科学学院第1页共2页1第十五章基因工程和蛋白质工程简介第一节DNA重组与基因工程第三节蛋白质工程简介第三节核酸研究技术简介第一节DNA重组和基因工程基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。一、DNA重组的技术路线二、基因工程的应用与前景三、DNA体外重组常用的酶DNA重组的技术路线1、目的基因的制备2、载体的构建3、目的基因与载体的重组4、重组体导入宿主细胞进行扩增5、克隆基因的鉴定DNA重组体的筛选:载体特征的直接筛选·菌落的原位杂交·免疫学方法DNA重组技术的应用(1)开辟生物学研究的新纪元·反向生物学（invesebiology）的诞生（2）促进生物技术产业的兴起_·基因药物·基因诊断和治疗第二节蛋白质工程简介在广泛利用自然界存在的各种蛋白质的过程中发现。这些蛋白质只是适应生物自身的需要，而对于它们的产业化开发往往并不合意，需要加以改造。1983年美国基因公司的Ulmer首先提出蛋白质工程这个名词，它是指按照特定的需要，对蛋白质进行分子设计和改造的工程。自此之后，蛋白质工程迅速发展，生物工程的重要组成部分。蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质一级结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累成千上万蛋白质一级结构和高级结构的数据资料，然后按照蛋白质形成的规律，经周密的分子设计，改造蛋白质或构建新的蛋白质。研究最多，取得成果最显著的是生物技术药物（激素、细胞因子、酶、酶的激活剂、受体和配体、细胞毒素和杀菌肽以及抗体等）和工业用酶的蛋白质工程。一、蛋白质工程的概念p489川大二、蛋白质工程的一般技术三、蛋白质工程的应用生物酶工程示意图酶的蛋白质结构功能新酶分子蓝图选择性修饰方案突变酶新酶克隆酶产品效用发展酶基因遗传设计遗传修饰DNA重组技术DNA重组技术蛋白质技术和核酸技术的相互增强插入表达载体转化寄主细胞推导出AA顺序制备合成肽制备对所编码蛋白专一的抗体基因或cDNA蛋白质蛋白质测定出AA顺序合成cDNA探针制备专一的抗体沉淀核糖体分离mRNA用Southern印迹法筛选DNA文库基因或cDNADNA重组的技术路线ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmoleculeIntroductionintohostcellsbytransformationofviralinfectionHostchromatemeSlectionforcellscoteiningarecombinantDNAmoleculeCloning+1、目的基因的制备2、载体的构建3、目的基因与载体的重组4、重组体导入宿主细胞进行扩增5、克隆基因的鉴定生物化学：第十五章基因工程和蛋白质工程简介华中师范大学生命科学学院第2页共2页2第三节核酸研究技术简介一、DNA序列测定二、基因文库与cDNA文库三、聚合酶链式反应（PCR）一、DNA测序的基本战略：设法产生带标记的不同长度的成套DNA片段，各带有标记的片段起点相同、终点不同，使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处都有断裂或终止。通过PAGE电泳，能够将相差一个核苷酸的DNA片段分开，放射自显影后，根据长短排列，根据特定末端碱基的DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列。·酶法·化学法·测序技术进展二、基因文库与cDNA文库1．基因文库（genomiclibrary）cDNA文库（complementalDNAlibrary）2.文库的构建基因文库基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。应用DNA重组技术，可以将各种生物体全部基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以备需要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称其为genomiclibrary。基因文库中应包含多少DNA克隆才能使任意所需要的基因以极高的概率存在于该文库中？其计算公式如下：N=ln(1-p)/ln(1-f)N：基因文库所包含克隆的数目；p：任意所需基因存在的概率，要求大于99%；f：克隆的DNA片段大小（bp）占基因组大小(bp)的分数。cDNA文库真核细胞基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。真核生物基因不能在原核生物中表达，只有将加工成熟的mRNA反转录成cDNA（complementalDNA）接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达。再有，真核生物的基因通常只有一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关mRNA都通常通过对其cDNA来进行研究的。将细胞全部mRNA反转录成cDNA并被克隆的总和称为cDNA文库。RNA病毒的基因组是RNA，也必须将RNA先转录成cDNA，再建立文库。为使低丰度的mRNA的cDNA克隆存在的概率大于99%，cDNA文库应含的克隆数的计算公式如下：N=ln(1-p)/ln(1-1/n)N：cDNA文库所包含克隆的数目；p：低丰度cDNA存在于基因文库中的概率，要求其大于99%；1/n：每一种低丰度的mRNA占总mRNA的分数。三、聚合酶链式反应（PCR）（1）PCR的原理1985年Mullis发明PCR（polymerasechainreaction）快速扩增DNA的方法。该法模仿体内DNA的复制过程，首先使DNA变性，两条链解开，然后使引物模板退火，二者碱基配对，DNA聚合酶随即以4种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的DNA新链。重复此过程，DNA以指数方式扩增。扩增的公式为:Y=(1+X)n式中y：产量；X：扩增效率；n：循环次数。（2）PCR的应用PCR技术的发展与应用·用于合成特异探针；·用于DNA的测序；·将逆转录与PCR相偶联（RT-PCR）；·用于基因定位诱变；·末知序列的PCR扩增；·基因组序列的比较研究；·用于临床诊断。DNA芯片技术简介DNA芯片(DNAchip)技术是采用寡核苷酸原位合成或显微打印手段，将数以万计的DNA探针片段有序地固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，反应结果通过检测杂交信号的方法（同位素法、化学荧光法、化学发光法或酶标法）显示，再用精密的扫描仪或CCD摄象技术记录，通过计算机软件分析，综合成可读的IC总信息，来实现对生物样品的快速、并行、高效地检测或诊断。测序技术进展同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳多色荧光标记毛细管电泳单色荧光标记平板电泳同位素标记平板电泳ACGTACGT测序图谱TATTGCATTGTCTGCATTGTCT