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第九章基因工程技术育种第一节基因工程概述第二节鱼类的基因工程技术育种★1、概念：是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。第一节基因工程概述也称为DNA重组技术(DNARecombination)或分子克隆(Molecularcloning)★2、诞生：1971年，美国Smith,H.O.等分离出一种限制性酶，可酶切病毒的DNA分子；1972年：Ｂerg,P.等实现不同酶切DNA片段的体外连接；1973年：Cohen,s.等将体外重组的DNA转入大肠杆菌细胞并得以表达。★３、基本过程：⑴从供体细胞中分离出目的基因(“切”)；⑵用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片断接到载体上，形成DNA重组分子(“接”)；⑶借助细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞(“转”)；⑷培养转化细胞，以扩增DNA重组分子，使其整合到受体细胞的基因组中（“增”）；⑸鉴定转化细胞，获得外源基因高效表达细胞（“检”）；基因工程的操作过程可简化为：切、接、转、增、检目的基因的分离与鉴定(一)从基因库中分离基因(二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因(三)人工合成基因★限制性内切核酸酶(restrictionenzymes)：在细菌中此酶的功能是降解外来DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染。第Ⅱ类限制性酶：能识别一段特异的DNA序列，准确地酶切双链DNA的特异序列—回纹对称序列。载体一个DNA片段只有与适合的载体DNA连接构成重组DNA后，在载体DNA的运载下，才可以高效率地进入宿主细胞(hostcell)，并在其中复制、扩增、克隆出多个拷贝。可作为DNA载体的有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体（BAC、YAC）等。(vector)★作为载体DNA分子，需具备四个条件：⑴具复制原点(ori)，能携带的外源DNA片段独立地自我复制；⑵具有多克隆位点，即具有多种限制性酶的切点，用于克隆外源DNA片段；⑶至少具有一个选择标记基因；⑷易从宿主细胞中回收。1.细菌质粒◆质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。☆这些质粒的适应范围广，拷贝数多。进入宿主细胞复制后，每个细胞的质粒拷贝数可高达1000个。2.λ噬菌体3.穿梭载体•DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5′-磷酸根和3′-羟基生成磷酸二酯键。这种反应需要供给能量，大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD+作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。DNA连接酶(DNAligase)修复双链DNA缺口处的磷酸二酯键•连接多个平头双链DNA分子：目的基因与载体的连接(DNA分子重组)重组DNA分子导入宿主细胞●转化(transformation):指将质粒DNA或以它为载体构建的重组质粒导入细菌中的过程。●转染(transfection):指病毒及其重组子导入受体细胞的过程.●转导(transduction):指噬菌体及其重组子导入受体细胞的过程转化(1)氯化钙法●1970年M.Mandel和A.Hige发现,大肠杆菌经过氯化钙适当处理及短暂热休克之后,便能吸收λ噬菌体DNA。1972年美国斯坦福大学S.Cohen报道,经氯化钙处理大肠杆菌细胞也能摄取质粒DNA。(2)电穿孔法电穿孔法(electroporation):是指在一个较大的电脉冲短暂破坏细胞膜的脂质双层，从而允许DNA等分子通过细胞膜进入细胞，而后细胞膜快速复原，保持细胞的完整。这种方法称为电穿孔法。•转化子的鉴定•转化子的外源基因表达★4.基因工程的应用(一)基因工程工业(二)植物基因工程(三)转基因动物(四)基因治疗◆胰岛素的人工生产◆植物基因工程根癌农杆菌介导的植物转化◆植物基因转化：是指将外源基因转移到植物细胞内、并整合到植物基因组中稳定遗传和表达的过程。◆根癌农杆菌介导的植物转化◆转基因动物与转基因植物相比，转基因动物的发展要慢些。◆例如，利用转基因羊大量表达人类的抗胰蛋白酶。◆将人的抗胰蛋白酶α-1基因克隆在羊奶产生相关基因启动子的下游，这种启动子仅在乳腺细胞中表达，使羊奶中含有大量有功能的人类抗胰蛋白酶；◆可利用家禽作为生物反应器，生产人类大量需要的重要蛋白质。◆基因治疗◆利用基因工程技术，将特异基因导入并整合到具有遗传缺陷的患者的基因组中，以治疗遗传疾病的方法，通常叫做基因治疗(genetherapy)。◆目前最常用的方法是利用病毒DNA作载体，构建重组DNA分子，用病毒包装物包装后形成的重组去毒病毒感染患者的细胞，将正常基因整合到染色体上。第二节鱼类基因工程以鱼类为研究对象，应用基因工程技术于鱼类遗传育种和海水鱼类资源开发研究的一门应用性，技术强的分支学科。本节以海洋鱼类为研究对象进行介绍。进入上世纪90年代，我国水产品总量已跃居世界首位，水产养殖产量超过捕捞产量，水产业的发展由捕捞型转向增养型。其中，海水养殖的发展尤为迅速。相比贝类和虾类养殖，海水鱼类的养殖发展较慢。制约因素较大的是越冬问题，多数海水养殖品种在4℃以上才能越冬，8℃以上才能摄食和维持缓慢生长。其次海水鱼的遗传育种和全人工繁殖育苗问题尚未彻底解决，育苗成活率较低。根据目前研究现状和发展趋势，海水鱼类基因工程的研究内容主要为：分离和克隆海水鱼类中的有用基因;筛选适用海水鱼类基因克隆和表达的载体及表达体系。利用转基因技术，将外源基因导入海水鱼中，培育性状优良的转基因海水鱼类品系。1.海水鱼类基因的分离和克隆基因的分离包括构建基因文库和从基因文库中筛选分离目的基因两大步骤。几种重要的海水鱼类基因生长激素基因抗冻蛋白基因催乳素基因和生长催乳素基因抗冻蛋白基因大多数海水鱼类的血清在-0.6℃即冻结，因此无法在温度过低的海域中生存，但仍有一些海水鱼类可以生存在这些严寒海域中。早在1957年，Scholander等人首次观察和研究了这些鱼类的抗冻特性。他们发现在北极海水鱼的血清中存在一种生物大分子，它们起着降低血清凝固点的作用。此后，DeVries等人从南极鱼血清中分离和分析了这种生物大分子，发现它们是一类有特殊化学结构的糖蛋白，称为抗冻糖蛋白（AFGP）。上世纪80年代，加拿大Choy等人发现了另一类抗冻蛋白。他们从产自北大西洋沿岸海域的美洲大绵鳚、冬鲽和杜父鱼中分离出3种类型的抗冻蛋白（AFP）。当AFP增至一定浓度，可以完全抑制冰晶的形成，因此即使在低于-1.7℃的低温条件下，含有一定浓度AFP的血清也不会冻结，这就是极地和北大西洋海域的海水鱼能够在严寒海水中生存的原因。用这几种抗冻蛋白基因构建的各种表达重组体已经成功地应用于转抗冻蛋白基因鱼类的研究和基因工程菌表达生产抗冻蛋白的应用研究。2.海水鱼类的基因转移在海水鱼类基因工程育种研究方面，目前所开展的工作主要是应用转基因技术将外源目的基因导入受体鱼类的生殖系细胞内，使之整合于受体细胞的染色体中，通过改变受体鱼遗传物质组成的方式达到培育优良性状的新品种的目的。鱼类转基因技术研究始于淡水鱼。1985年，我国学者朱作言等人首次报道了转基因鱼试验成功。他们将小鼠金属硫蛋白启动子-人生长激素基因组体（mMT-hGH）导入金鱼受精卵中，获得了第一批转基因鱼。海水鱼类的转基因研究直到90年代初才有报道，加拿大研究者成功地将海水鱼的生长激素基因和抗冻蛋白基因导入鲑科鱼类，培育出个体较对照鱼30倍的“超级鱼”和能够表达抗冻蛋白的转基因大西洋鲑。我国研究者在世纪初也将海水鱼生长激素成功导入我国重要的海水经济鱼类真鲷和牙鲆，培育出生长速度明显加快的转基因海鱼群体。鱼类作为转基因研究的实验动物，比哺乳动物等具有更多的优点：鱼类怀卵量大，一次可产几万个至几十万个；大多数种鱼类的卵子卵径大，卵质透明，便于进行显微注射等遗传操作；鱼类是体外受精体外发育，易于进行人工受精和控制胚胎发育的条件。2.1.显微注射法显微注射法是目前最常用的方法，导入外源基因的成功率也比较高。主要包括两种方式：(1)卵母细胞的细胞核注射；(2)受精卵的细胞质注射。显微注射法的优点是外源基因的导入整合效率较高，缺点是需要贵重精密仪器，技术操作难度较大，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。并且，显微操作处理对鱼类卵子有机械损伤，受精卵的成活率受到很大影响。2.2电脉冲法外源DNA在电脉冲作用下进入受精卵。谢岳峰等(1989)以泥鳅脱膜受精卵为材料，电穿孔转移外源基因，获得了10%的转基因泥鳅。Powers(1992)采用电穿孔法和显微注射法，将线性化DNA导入斑马鱼、斑鲴和鲤受精卵。电穿孔法产生的转基因鱼数量比显微法的多。Zhao(1993)证明电穿孔导入的GH基因不仅能表达，而且还能遗传。Powers(1992)采用电穿孔法获得的转基因斑马鱼和鲤的子一代约一半携带外源基因并能有效表达。缺点优点操作比较简单，是处理大量的受精卵的理想方法。缺点是导入无定向性，转移率较低，针对不同种鱼需要建立相应的电脉冲条件(脉冲电压、脉冲时间、脉冲次数、间隔时间、脉冲介质)等。2.3精子载体导入法利用精子作为转基因载体，借助受精作用把外源基因导入受精卵，整合到受精卵的基因组中，是构建转基因动物的一种新的尝试。目前鱼类的成功报道有6种。Khoo等(1992)将斑马鱼精子与pUSVCAT质粒在PBS中22℃保育30~40min，得到23.3%(环状质粒DNA)和37.5%(线状质粒DNA)的阳性率。Sin等(1993)将大鳞大麻哈鱼的精子与外源基因混合，经电脉冲处理后再受精，获得5％～10%的转基因阳性率。于健康等(1994)将金鱼精子与AFP基因在Niu—Twitty液中4℃保温30min后，再与卵子受精，经PCR法和Southernblot分子杂交法检查，阳性率为26%。该法较简单、方便，依靠生理受精过程，免去了对原核的损伤。通过此法获得的精卵受精和受精卵成活率几乎不会受到影响。但精子携带基因转移法仍存在转基因阳性率低、转移率不稳定等缺点。2.4染色体片段显微注入法这是一种超大型外源DNA转移获得转移染色体鱼的方法。就是从染色体上显微切割特定的染色体片段，然后注入受体动物受精卵中。3.外源基因整合的检测方法转基因鱼是要求外源DNA分子能够插入宿主细胞的染色体DNA分子中。整合至宿主细胞基因组中，只有这样才能达到改变后者遗传物质组成，从而改变其遗传性状的目的。因此，整合率才真正反映了转基因的效率。影响整合率的主要因素有以下几个方面：（1）外源基因导入的时期。最好选择细胞分裂中期，细胞核膜消失，核染色体较为分散状态时，外源DNA分子有更多机会与宿主基因组DNA分子接触和作用。（2）外源基因导入的部位。一般认为外源DNA分子导入卵细胞核内最佳。在淡水鱼转基因研究中，已经报道了利用卵母细胞显微注射法进行金鱼转基因试验成功的结果。在海水鱼方面，至今尚未见成功的报道，主要是因为尚未解决海水鱼卵母细胞体外成熟的问题。因此目前海水鱼转基因操作主要是控制外源基因导入的时期。外源基因整合的检测：有DNA点杂交，Southern杂交及PCR反应等方法。4.外源基因表达的检测整合至受体鱼染色体中的外源基因是否能在导入的外源启动子作用下正常表达，需要进行外源基因表达的检测。基因的表达分为转录水平和翻译水平两级。研究进展：据认为，转基因鱼是目前国内最早成功的一种转基因动物。早在1985年，朱作言等就率先在世界上获得转基因鲫鱼，后来又先后获得了转基因泥鳅、鲤、团头鲂和鲮等。从总体上看，我国鱼类基因转移技术已达到世界先进水平。关于促进鱼类生长的生长激素基因工程方面，加拿大、日本、美国、英国等国家的科学工作者都有研究。英国南安普教大学用基因工程技术培育出超鲜鱼，不仅个体大、生长快，而且能在普通虹鲜不能生存的环境中生存。后来又对其他基因，如抗冻蛋白基因工程操作等，获得了很好的成效。