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第十一章植物生殖工程第一节概述一、植物生殖工程概念植物生殖工程：是通过控制和利用植物有性生殖过程而改良植物的应用技术领域，主要指在离体条件下以生殖细胞和原生质体为对象所进行的遗传操作，包括整个有性生殖过程的控制和利用。与体细胞工程比优点：①有性生殖是大多数植物的自然生殖过程，是一种阻力较少的途径。②生殖过程中提供了许多基因操作的机会．如花粉管是引导雄配子完成受精作用的运载工具，具有作为外源基因载体的功能。③植物生殖系统中拥有许多天然的单倍体细胞，可以直接制备单倍体原生质体。④生殖系统中丰富多样的细胞类型可用于不同研究途。⑤单倍性的生殖细胞经过减数分裂发生了各种形式的遗传重组，具有极大的遗传变异性，因此通过生殖工程操作可以直接获得各种类型的新个体。植物生殖工程包括二大生殖系统：雄性生殖系统和雌性生殖系统两种操作方式；活体操作和离体操作；三个研究水平：即器官、细胞和原生质体水平。二、植物生殖工程的基本操作1、器官水平操作A、试管授粉试管授粉或试管受精是指为了克服交配的不亲和性，离体培养子房或胚珠而在试管中完成受精过程。B、子房和胚珠培养受精子房和胚珠培养的目的也是在于克服杂交或自交胚的败育。未受精子房和胚珠培养既是诱导卵器细胞形成单倍体植株进行单倍体育种的途径，又是研究人工诱导无融合生殖和实验生殖生物学的好方法。C、胚和胚乳培养胚培养是克服远缘杂交困难经常采用的方法。胚乳是极核受精的产物，一般多为3n。因此进行胚乳培养的目的之一，在于培养三倍体植株以获得无籽的瓜果，如无籽西瓜、无籽柑桔和无籽枇杷等。D、花药培养离体培养花药是大量获得单倍体进行单倍体育种和遗传学研究的重要技术，也是研究雄核发育等生殖生物学问题的良好方法。2、细胞水平的操作（1）大孢子母细胞、大孢子和胚囊的分离（2）花粉培养花粉培养的优点是：A、可以直接研究花粉细胞的发育、脱分化与再分化过程。B、体细胞组织来源的愈伤组织或胚状体形成的植株及混倍体的频率均可大幅度降低。C、可以减少体细胞对花粉细胞发育的竞争和抑制作用，提高花粉诱导频率和成苗率。3、原生质体的分离与培养它包括卵及其他胚囊分子的分离、花粉原生质体的分离与培养、生殖细胞与精细胞的分离与培养、配子—体细胞融合的研究、受精工程的尝试等等。第二节未受精子房和胚珠培养一、概述SanNoeum(1976)首次利用大麦未受精子房培养出单倍体植株，该项研究成功的意义在于开辟了单倍体育种的另一途径，这对于花粉培养尚未获成功的物种尤为重要.二、未受精子房和胚珠培养技术①选择基因型材料；②确定接种期；③选择培养基；④采用一定的接种方式，如固体培养、液体漂浮培养、平放或直插等；⑤保温培养；⑥染色体鉴定；⑦染色体加倍；⑧胚囊植株及其后代观察。三、胚囊植株的起源①卵细胞孤雌生殖为主②助细胞的无配子生殖③反足细胞无配子生殖④其他类型四、胚囊植株的遗传表现胚囊植株中的单倍体比例较高，二倍体比例较低，混倍体较少。而且胚囊植株绿苗率高(可达89．3％)，白化苗率低(8．8％)，与花粉植株白化苗率高的特点呈鲜明的对比，构成了子房培养的一个十分突出而且十分有意义的特点。五、植物遗传工程的受体—胚囊①胚囊内的卵细胞、助细胞和中央细胞在子房成熟时期呈现部分无壁的状态②单倍体③世代交替的转折期与再生潜能④胚囊体积大，胚囊壁结构特殊第三节花药和花粉培养一、花药和花粉培养的意义花药和花粉培养最易大批量地获得单倍体，并且从花药或花粉获得的单倍体植株可以经自发或诱发染色体加倍而形成纯合二倍体，因此应用得最为广泛。此外，花药内花粉数量多，本身为单倍体细胞，离散性好，发育同步性高，因此在遗传操作中具重要作用。二、花药培养的基本技术和影响因素基本过程包括：①挑选适宜的基因型作材料；②确定花粉发育时期；③材料的预处理；④诱导培养；⑤分化培养；⑥染色体数观察和染色体数加倍；⑦花粉植株当代及后代观察鉴定。影响因素：1、材料基因型：茄科、禾本科、十字花科的植物所占比例较大。2、材料的预处理：①低温预处理；②离心预处理；③高温预处理或预培养。三、雄核发育途径、饥饿与花粉二型性1、雄核发育的途径①营养细胞发育；②小孢子发育；③营养核、生殖核共同发育；④生殖核发育；⑤其他发育类型。2、花粉的二型性：指同一花药中存在两类不同的花粉。一类为正常花粉，它们的细胞质较浓，发育较一致，染色较深；另一类为异常花粉，这类花粉较小，它们的细胞质较淡、染色较浅，发育落后。Sunderland等在研究花药培养的发育途径中发现后一类花粉具有雄核发育能力，形成花粉胚，因此特称为胚性花粉或E花粉.从曼陀罗、烟草等植物中观察到花药(粉)培养诱导率与这种E花粉的多少有关，因此认为选择E花粉多的材料，是花药和花粉培养的关键。小孢子胚胎发生机制在烟草花药培养中发现，胚胎发生的小孢子的蛋白质和RNA含量仅及无胚胎发生的花粉粒的六分之一。某些物质的亏缺即“饥饿”被看作是胚胎发生启动的重要条件。蔗糖饥饿四、花粉培养花粉培养是以游离花粉粒进行直接培养药壁组织对小孢子的启动发育可能提供重要的促进物质，称为花药因子。作用：①在花粉去分化中药壁组织向花粉提供了必要的营养物质。②药壁组织吸收、贮存和转化培养基中的外源物质，起着花粉代谢库的作用。Chuong和Beversdorf(1985)在油菜游离花粉培养中也获得重大进展，在一定条件下高频率地诱导出胚状体，最高使每个花药的花粉形成54个胚状体。①将适期花药的花粉离散出来，先在32℃下培养3d，然后转入25℃下培养3-4星期。②用13％蔗糖改良Nitsch培养基加入lmg／LNAA和0．5mg／LBA进行诱导培养。五、花粉植株的遗传研究花药培养产生的花粉植株常出现染色体数和染色体倍数性的各种变异类型。烟草花药培养通过胚状体途径形成的花粉植株几乎全是单倍体。禾本科植物花药培养主要经愈伤组织途径形成植株，染色体倍性比较复杂。水稻和小麦花粉植株中以单倍体为主，也有少数二倍体。在小麦中发现有多倍体、混倍体或非整倍体如缺体等。玉米、大麦花粉植株中多数为混倍体，典型单倍件与二倍体植株却较少。禾本科花药培养的另一障碍是产生白化苗。在水稻中产生白苗的趋势是野生稻籼稻粳稻。对水稻白苗的一系列研究表明，白化苗产生是由于叶绿体不能正常形成，而叶绿体的异常是由于存在于细胞质中的rRNA缺失。第四节胚囊类细胞的分离一、意义胚囊类细胞是大孢子母细胞、大孢子、胚囊的细胞的合称。胚囊分离技术的建立，对于研究和利用胚囊类细胞具有十分重要的意义。①胚囊细胞是天然单倍体②可以直接研究生活胚囊③进行雌性生殖系统的再生与发育研究④提供离散的卵⑤用活胚囊为受体进行遗传操作与基因转化研究二、分离方法1、酶解涂抹法：用果胶酶处理雀稗属(Paspalum)的几个种的子房，使子房壁离解疏松，然后挑出离解的子房置于玻片上进行涂抹，观察到成熟胚囊的基本结构。2、酶解振荡法：将固定或活体的胚珠置于含有纤维素酶、果胶酶或蜗牛酶及一定渗透稳定剂、膜稳定剂的酶液中，在小型振荡器上保温(28--30℃)连续振荡酶解，使珠被组织离散，再经过离心分离、清洗纯化，获得较清净的胚囊类细胞，最后进行显微观察和细胞学研究。3、酶解压片分离法①获得无菌胚珠②酶解：将生活胚珠放入酶液中28℃黑暗条件下处理3．5-4h.③清洗：用0.6mol／L甘露醇洗净酶液④压片：滴一滴含有酶解后胚珠的液体于载玻片上，加上盖玻片。⑤观察：制好的压片用石蜡封边后在相差显微镜下观察。。④压片：滴一滴含有酶解后胚珠的液三、问题①胚囊壁及胚囊周围组织的结构特异性。②酶类的应用：木质化或栓质化的组织，采用目前应用的酶类去分离则比较困难。③胚囊数少第五节植物性细胞原生质体的分离、培养和融合与体细胞相比，性细胞具有其独自的特色：第一，它们具单倍性基因组，遗传组成单一。第二，它们经历两性分化与一系列的发育程序，产生形态与生理各异的多种细胞类型。第三，它们适应于有性生殖，能通过传粉受精，繁殖种子与后代。一、原生质体分离1、花粉原生质体的分离花粉具有结构简单、单倍体遗传组成、发育同步、数量众多、参与传粉受精作用等特点。三条技术路线：化学药品降解花粉壁非酶脱壁酶解法一步酶解法花粉置于酶液中，通过水合膨胀，使外壁沿萌发沟裂开，内壁大面积地暴露在酶的作用之下而分解，释放出原生质体。水合-酶解二步法第一步，花粉在蔗糖液内充分水合，使外壁裂开。第二步，转入酶液，降解内壁，获得原生质体。甘蓝型油菜与紫菜苔、凌霄花萌发-酶解二步法第一步是将成熟花粉置于花粉萌发培养基中，待花粉大量萌发，长出短花粉管，及时转入第二步，在酶液中酶解。由于花粉管尖端的壁为果胶质与纤维素所组成，酶液由此处开始降解花粉管壁，再扩展至降解花粉内壁，从而释放出原生质体。烟草。影响分离效果的因素(1)植物种类(2)花粉发育时期(3)酶的种类(4)酶液渗透压(5)新鲜与保存花粉2、生殖细胞与精细胞的分离细胞核大，细胞质与细胞器稀少，核质比很高。类似天然的单倍性的核质体，在植物性细胞工程中有特殊作用。生殖细胞的分离(1)一步渗透压冲击法花粉置于低渗蔗糖溶液中保温一段时间后，花粉自行破裂，生殖细胞随营养细胞质流出。棉花(2)二步渗透压冲击法花粉置于等渗蔗糖溶液中培养，当大部分花粉开始萌发时，加入蒸馏水使渗透压骤降，导致花粉破裂释放生殖细胞。石蒜、风雨花、玉帘、烟草、凤仙花、蚕豆(3)低酶法花粉在低浓度酶(一般为0．1％纤维素酶与0．1％果胶酶)与低渗蔗糖溶液中保温，促使花粉破裂释放生殖细胞。黄花菜、韭菜、朱顶红、唐菖蒲、鸢尾(4)花粉原生质体释放法首先分离出花粉原生质体，然后用渗透压冲击法或机械法，使花粉原生质体破裂，获得生殖细胞。鸢尾、唐菖蒲、朱顶红、风雨花等。精细胞的分离三细胞花粉二细胞花粉(1)三细胞花粉的精细胞分离方法研磨法：用玻璃匀浆器轻轻研磨花粉悬浮液，使花粉壁破碎，释放出精细胞。甘蓝型油菜、甘蓝、紫菜苔、非洲菊、菠菜渗透压冲击法：将花粉置于低渗溶液中，使花粉自行破裂。白花丹、玉米、小麦、甜菜(2)二细胞花粉的精细胞分离活体--离体法：将花粉授于柱头上，切下一定长度的花柱插入液体培养基中。当花粉管由花柱切口中长出后，用渗透压冲击或酶液处理，促使花粉管尖端破裂释放精细胞。杜鹃花、唐菖蒲、鸢尾、棉花、朱顶红、烟草、黄花菜、萱草、离体萌发法：花粉置于培养基中人工萌发，待生殖细胞在花粉管中已分裂形成精细胞之后，用渗透压冲击等方法使花粉管破裂，释放出精细胞。3、胚囊内成员细胞的分离一般先用人工解剖法除去子房壁，然后以胚珠为单位分离出胚囊，再由胚囊分离出其成员细胞。酶法胚珠置于酶液中酶解，使珠被与珠心细胞离散，裸露出胚囊。一般需在酶解的基础上，适当辅加机械处理，如吸打、压片或解剖，以提高分离胚囊的效果。解剖法应用显微操作器直接解剖胚囊及其成员细胞，技术上较难，效率较低。二、原生质体体培养1、花粉原生质体的培养花粉原生质体也有配子体发育与孢子体发育两条途径。成熟花粉原生质体培养能够萌发出花粉管，其中生殖细胞分裂形成精细胞，表现出配子体发育的趋势。2、生殖细胞培养吴新莉与周嫦将分离的黄花菜生殖细胞在含多种附加物以及花药作为饲养物的MS琼脂培养基中离体培养，部分细胞发生1-2次核分裂，形成2—4核的细胞。平均分裂率为3．27％，最高分裂率达11．46％。3、胚囊与卵细胞培养最近，Holm等培养大麦受精的卵细胞，发生了细胞分裂。单独的受精卵培养能够发育到小愈伤组织；用大麦小孢子作饲养物，受精卵能发育成胚状体，最后达到成熟植株，开花结实。三、原生质体融合1、性细胞与体细胞之间的融合1986年首次报道粘毛烟草四分体原生质体和普通烟草硝酸还原酶缺陷型的叶肉原生质体的融合及其融合体再生植株。最近，在幼嫩花粉原生质体分离成功的基础上，游离时期的花粉原生质体与体细胞原生质体的融合获得成功。李昌功等青菜幼嫩花粉原生质体*甘蓝型油菜下胚轴原生质体融合了小植株。2、性细胞与性细胞之间的融合性性融合有多种组合，其中以精卵融合工作进