第十六章基因和蛋白质工程

第十六章基因工程和蛋白质工程简介第一节DNA重组与基因工程第二节蛋白质工程简介第三节核酸研究技术简介返回第一节DNA重组和基因工程基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。一、DNA重组的技术路线二、基因工程的应用与前景三、DNA体外重组常用的酶DNA重组的技术路线ForeignDNAtobeinsertedPlansmidvectorJoiningRecombinantDNAmoleculeIntroductionintohostcellsbytransformationofviralinfectionHostchromatemeSlectionforcellscoteiningarecombinantDNAmoleculeCloning+1、目的基因的制备2、载体的构建3、目的基因与载体的重组4、重组体导入宿主细胞进行扩增5、克隆基因的鉴定Ti质粒结构植物冠瘿瘤pBR322质粒的结构以噬菌体为载体进行DNA克隆DNA用限制性内切酶除去中间一段与外源DNA连接重组载体的体外包装带有外源DNA的噬菌体太小不能被包装头部前体多联体DNAA蛋白COSCOSCOS成熟的颗粒在宿主细胞内进行DNA的装配过程噬菌体感染大肠杆菌的途径DNA重组体的筛选载体特征的直接筛选菌落的原位杂交免疫学方法pBR322质粒结构如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活如果外源DNA插入，四环素抗性基因失活原位杂交法筛选DNA重组体图解复印至硝酸纤维素膜上用NaOH菌体裂解DNA变性杂交放射自显影32P-cDNA与放射性cDNA杂交的菌落的斑点细菌菌落单链DNA结合到膜上Southern印迹法DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记DNA探针杂交放射自显影带有DNA片段的凝胶凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜Southern和Western印迹法DNAfrangmentElectrophoresisTransferofDNAbyblotting32P-labledDNAprobeAutoradiographyAgarrosegelAutoradiogramNitrocellulosesheetAutoradiogramPolymersheetSDS-PolyacrylamidegelTransferproteinAddradiolabledspesficantibody,WashtoremoveunboudantibodyProteinbanddetectedbyspecificantibodyAutoradiographyDNA重组技术的应用(1)开辟生物学研究的新纪元反向生物学（invesebiology）的诞生（2）促进生物技术产业的兴起基因药物基因诊断和治疗转基因动植物胰岛素原的人工合成胰脏(A)n胰岛素原mRNAcDNA重组质粒转化细菌mRNA反转录酶胰岛素原基因与质粒连接感染E.coli胰岛素原Ti质粒为载体的植物基因工程I二元载体系统II共整合载体IIIT-DNA的转移与整合Ti辅助质粒Ti辅助DNA给体质粒Ti辅助DNA给体质粒pBR型质粒（给体质粒）宿主特异性外源基因宿主特异性整合带有外源基因的Ti质粒植物DNATi质粒转移并插入植物DNA第二节蛋白质工程简介蛋白质技术和核酸技术的相互增强在广泛利用自然界存在的各种蛋白质的过程中发现。这些蛋白质只是适应生物自身的需要，而对于它们的产业化开发往往并不合意，需要加以改造。1983年美国基因公司的Ulmer首先提出蛋白质工程这个名词，它是指按照特定的需要，对蛋白质进行分子设计和改造的工程。自此之后，蛋白质工程迅速发展，生物工程的重要组成部分。蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质一级结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累成千上万蛋白质一级结构和高级结构的数据资料，然后按照蛋白质形成的规律，经周密的分子设计，改造蛋白质或构建新的蛋白质。研究得多，取得成果最显著的是生物技术药（激素、细胞因子、酶、酶的激活剂、受体和配体、细胞毒素和杀菌肽以及抗体等）和工业用酶的蛋白质工程。生物酶工程示意图酶的蛋白质结构功能新酶分子蓝图选择性修饰方案突变酶新酶克隆酶产品效用发展酶基因遗传设计遗传修饰DNA重组技术DNA重组技术蛋白质技术和核酸技术的相互增强插入表达载体转化寄主细胞推导出AA顺序制备合成肽制备对所编码蛋白专一的抗体基因或cDNA蛋白质蛋白质测定出AA顺序合成cDNA探针制备专一的抗体沉淀核糖体分离mRNA用Southern印迹法筛选DNA文库基因或cDNA第三节核酸研究技术简介一、DNA序列测定二、基因文库与cDNA文库三、聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）DNA测序的基本战略设法产生带标记的不同长度的成套DNA片段，各带有标记的片段起点相同、终点不同，使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处都有断裂或终止。通过PAGE电泳，能够将相差一个核苷酸的DNA片段分开，放射自显影后，根据长短排列，根据特定末端碱基的DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列。酶法化学法测序技术进展酶法序列分析的原理酶反应电泳方向模板CCGGTAGCAACT3´5´GG5´3´引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTACGTAGTTGCTACC3´5´TCAACGATGG5´3´读出模板互补序列读出模板序列GGCCATCGTTGAGGCCATCGTGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGGGCCATCGGCCAGGCCATGGCCGGCDNA的Sanger测序法(酶法)读出模板互补序列dNTP凝胶电泳较大片段较小片段ddGTPddATPddCTPddTTP反应混合物Klenow酶未知序列的单链DNA读出待测序列CTGACTTCGACAAAGAA5´3´放射性标记的引物TGTTACTGddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3´5´CTGACTTCGACAA5´3´DNA的测序仪示意图computeranalysis凝胶中DNA移动方向样品槽激光器输入光学系统成象透镜聚焦透镜高灵敏度相机旋光镜/棱镜组件DNA的化学测序示意图反应试剂G反应：硫酸二甲酯G+A反应：甲酸T+C反应：肼C反应：NaCl+肼测序技术进展同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳多色荧光标记毛细管电泳单色荧光标记平板电泳同位素标记平板电泳ACGTACGT测序图谱TATTGCATTGTCTGCATTGTCT引物标记法测序(DyePrimer)一个样本，4个反应。4个反应中引物序列相同，但分别标记有不同颜色的荧光。+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddATP(terminator)+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddCTP+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddGTP+AmpliTaqFSenzymedCTP,dATP,dGTP,dTTPddTTP反应结束后，将4管反应液混合，经乙醇沉淀后上样终止法测序(DyeTerminator)一个样本，1个反应。反应中包含分别带4色荧光标记的ddNTP(终止子)unlabeledprimertemplateDNA+AmpliTaqFSdATP,dCTP,dGTP,dTTPddCTPddATPddGTPddTTP测序反应结束后，采用乙醇沉淀法进行纯化，除去过量的ddNTP后上样。三．基因文库与cDNA文库1．基因文库（genomiclibrary）cDNA文库（complementalDNAlibrary）2.文库的构建基因文库基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。应用DNA重组技术，可以将各种生物体全部基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定重组体中，以备需要时应用。好象将文献资料贮存于图书馆一样，所以称其为genomiclibrary。基因文库中应包含多少DNA克隆才能使任意所需要的基因以极高的概率存在于该文库中？其计算公式如下：N=ln(1-p)/ln(1-f)N基因文库所包含克隆的数目；p任意所需基因存在于基因文库中的概率，要求大于99%；f克隆的DNA片段大小（bp）占基因组大小(bp)的分数。cDNA文库真核细胞基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。真核生物基因不能在原核生物中表达，只有将加工成熟的mRNA反转录成cDNA（complementalDNA）接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达。再有，真核生物的基因通常只有一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关mRNA都通常通过对其cDNA来进行研究的。将细胞全部mRNA反转录成cDNA并被克隆的总和称为cDNA文库。RNA病毒的基因组是RNA，也必须将RNA先转录成cDNA，再建立文库。为使低丰度的mRNA的cDNA克隆存在的概率大于99%，cDNA文库应含的克隆数的计算公式如下：N=ln(1-p)/ln(1-1/n)NcDNA文库所包含克隆的数目；p低丰度cDNA存在于基因文库中的概率，要求其大于99%；1/n每一种低丰度的mRNA占总mRNA的分数。基因文库和cDNA文库的建立组织可克隆之DNA载体DNAcDNAmRNA部分或完全酶解DNADNA长度分级甲基化，双链接头DNADNA与载体连接引入大肠杆菌鉴定文库的滴度和特性扩增后供长期储存筛选出所需要的克隆噬菌体为载体的基因文库的构建四、聚合酶链式反应（PCR）1985年Mullis发明PCR（polymerasechainreaction）快速扩增DNA的方法。该法模仿体内DNA的复制过程，首先使DNA变性，两条链解开，然后使引物模板退火，二者碱基配对，DNA聚合酶随即以4种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的DNA新链。重复此过程，DNA以指数方式扩增。扩增的公式为:Y=(1+X)n式中y一产量;X--扩增效率;n一循环次数。（2）PCR的应用（1）PCR的原理PCR技术原理示意图靶序列变性和引物复姓循环1循环2循环3变性和引物复姓链延伸Tag酶链延伸PCR技术的发展与应用用于合成特异探针；用于DNA的测序；将逆转录与PCR相偶联（RT-PCR）；用于基因定位诱变；末知序列的PCR扩增；基因组序列的比较研究；用于临床诊断。DNA芯片(DNAchip)技术是采用寡核苷酸原位合成或显微打印手段，将数以万计的DNA探针片段有序地固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，反应结果通过检测杂交信号的方法（同位素法、化学荧光法、化学发光法或酶标法）显示，再用精密的扫描仪或CCD摄象技术记录，通过计算机软件分析，综合成可读的IC总信息，来实现对生物样品的快速、并行、高效地检测或诊断。芯片分析实际上也是传感器分析的组合。芯片阵列中的每一个单元微点都是一个传感器的探头，所以传感器技术的精髓往往都被用于芯片的发展。阵列检测可以大大提高检测效率，减少工作量，增加可比性，所以芯片技术也是传感器技术的发展。DNA芯片技术简介DVA芯片工作示意图emissionLaser1Laser2computeranalysi