第四章酶工程与食品产业

第四章酶工程与食品产业第一节酶工程概述第二节酶的生产与分离纯化第三节固定化酶第四节酶反应器和酶传感器第五节酶工程在食品工业上的应用1．酶由生物体产生2．酶与生命活动密切相关3．酶主要是蛋白质酶的概念：酶主要是活细胞产生的具有催化作用的蛋白质1．酶由生物体产生11．酶由生物体产生22．酶与生命活动密切相关所有生命活动或过程都需要酶的参与（1）执行具体生理机能（2）降解大分子（3）协同激素起信号转化、传递、放大作用（4）催化代谢反应酶的组成和分布是生物进化与组织功能分化的基础在生物进化过程中形成了从酶的合成到酶的结构和活性各种水平的调节机构。3．酶主要是蛋白质1）相对分子质量大2）由氨基酸组成3）为两性电解质4）具有胶体物质的一系列特性5）引起蛋白质变性的物理及化学因素，同样也能使酶失活6）受蛋白水解酶作用而丧失活性酶有以下性质与蛋白质极为相似酶的催化特性1、与一般催化剂的共性2、作为生物催化剂的特性1、与一般催化剂的共性（1）用量少；效率高；反应前后质和量不变（2）加速化学反应的速度，不改变反应的平衡点(3)不能够触发热力学上不能进行的反应。（4）催化可逆反应的酶对正反应、逆反应都有催化作用（5）降低反应的活化能。（一）高度的催化效率（二）高度的特异性（三）可调节性2、作为生物催化剂的特性酶促反应活化能的改变活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。酶促反应活化能一般催化剂催化反应活化能能量反应过程反应总能量改变非催化反应活化能底物产物活化态酶的催化机理也是降低反应的活化能、是更大幅度地降低。酶的催化效率通常比非催化反应高108～1020倍，比一般催化剂高107～1013倍。酶的催化不需要较高的反应温度。2000J过氧化氢酶11700J胶态钯18000J无每摩尔需活化能催化剂过氧化氢分解反应所需活化能一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的产物。酶的这种特性称为酶的特异性/专一性。酶的特异性(specificity)绝对特异性(absolutespecificity)相对特异性(relativespecificity)立体结构特异性(stereospecificity)根据酶对底物结构选择严格程度分为3种类型：绝对特异性一种酶只能作用于特定结构的底物一种酶只能作用于特定结构的底物进行一种专一的反应进行一种专一的反应生成特定结构的产物生成特定结构的产物OCNH2NH2+H2O2NH3+CO2尿素脲酶OCNHNH2+H2O甲基尿素CH3脲酶例：相对特异性：果糖—葡萄糖果糖+葡萄糖蔗糖蔗糖酶果糖—葡萄糖—半乳糖果糖+葡萄糖—半乳糖棉子糖蜜二糖蔗糖酶例：蔗糖酶的水解作用有些酶作用于一类化合物或一种化学键有些酶作用于一类化合物或一种化学键AABBCCAABBCC立体异构特异性：L-乳酸D-乳酸例：L-乳酸脱氢酶有些酶仅作用于底物立体异构体中的一种有些酶仅作用于底物立体异构体中的一种CH3COOHOHCHCH3COOHCHOH对酶生成与降解量的调节酶催化效力的调节通过改变底物浓度对酶进行调节等酶促反应调节的三方面：酶活性部位和必需基团活性中心（活性部位）必需基团：活性部位活性中心为什么酶蛋白具有催化活性而非酶蛋白无催化活性？酶的活性中心必需基团(essentialgroup)酶的活性中心(activecenter)/或活性部位(activesite）活性中心内的必需基团活性中心外的必需基团结合基团催化基团多肽链结合基团底物分子催化基团酶活性中心活性中心内的必需基团+_活性中心外的必需基团酶活性中心示意图必需基团(essentialgroup)：结合基团(bindinggroup)：与底物相结合的基团催化基团(catalyticgroup)：催化底物转变成产物的基团酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的基团。酶的活性中心(activecenter)/活性部位(activesite）：必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。活性中心内的必需基团：活性中心外的必需基团：位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。几个名词：结合基团：与底物结合的必需基团催化基团：直接参与催化反应的必需基团必需基团分为两类第一节酶工程概述一、酶工程的概念酶工程:酶的大批量生产以及利用酶的催化作用,借助工程技术手段进行物质转化,生产人们所需要产品的技术。酶工程与发酵工程、基因工程、细胞工程的关系二、酶工程的内容根据酶工程研究和解决问题的手段不同，将酶工程分为化学酶工程和生物酶工程。（一）化学酶工程亦称初级酶工程，指自然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用。（二）生物酶工程生物酶工程主要包括三个方面：一是用基因工程技术大量生产酶(克隆酶)，二是修饰酶基因产生遗传修饰酶(突变酶)，三是设计新酶基因，合成自然界不曾有的酶(新酶)当前酶工程的主要任务是：研制分解纤维素和木质素的酶、使低分子有机物聚合的酶、检测用酶、能分解有毒物质的酶及废物综合利用酶。利用基因工程技术开发新酶品种和提高酶产量。固定化酶和细胞、固定化多酶体系及辅因子再生体系，特定生物反应的研究和应用。用微生物和动植物组织研究生物传感器。非水系统的反应技术，酶分子的修饰与改造以及酶型高效催化剂的人工合成研究。第二节食品酶的生产与分离纯化一、酶的生产获得酶制剂的方法有:化学合成从生物体内直接提取分离目前酶的生产主要以微生物为原料。（一）对酶生产菌的要求1、不能是致病菌。可用于食品的有枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉、啤酒酵母等2、不易退化，不易感染噬菌体。3、产酶量高，而且最好产生胞外酶。4、能利用廉价的原料，发酵周期短，易培养。生产菌种的获得:除了从菌种保存机构和有关部门获得外，一般都有要通过筛选得到。筛选包括：菌样采集、菌种分离、纯化和生产性能检定。例如：纤维素酶是一种复合酶，包括葡萄糖内切酶（EG):作用于纤维素分子内部的非结晶区,随机水解β-1,4糖苷键,产生小分子纤维素.葡萄糖外切酶（纤维二糖水解酶，CBH）:作用于纤维素分子末端,水解β-1,4糖苷键,每次切下一个纤维二糖分子.β-葡萄糖苷酶（BG）:水解纤维二糖和小分子纤维素,生产葡萄糖.生产纤维素酶的主要菌种有:细菌:纤维素酶产量低,为胞内酶或吸附在细胞壁上,提取纯化困难。研究较多的为纤维素黏菌属、生孢纤维素黏菌属、纤维粘杆菌属。霉菌：目前生产纤维素酶的微生物大多为霉菌。研究较多的为木霉属、曲霉属、根霉属、漆斑霉属，纤维素酶产量高。纤维素酶的提取分离方法有分级沉淀、电泳法、层析法、凝胶过滤法、离子交换法、等电点聚焦法等纤维素酶在食品工业中的应用果汁生产促进果汁的提取澄清，提高可溶性固形物含量，促进果皮渣综合利用。如柑橘皮经纤维素酶解香料生产用纤维素酶处理后再提取可提高香料的产量。果蔬生产种子蛋白利用：用于大豆脱皮速溶茶的生产可发酵糖的生产琼脂生产酱油酿造酒精酿造淀粉酶是水解淀粉的酶类，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、异淀粉酶α-淀粉酶：随机水解淀粉分子内部的α-1,4糖苷键,不能水解α-1,6糖苷键.水解产物为分子量不等糊精、少量低聚糖、麦芽糖、葡萄糖.生产菌种:主要来自于细菌（枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，尤其是耐热的α-淀粉酶）和曲霉。β-淀粉酶:从淀粉分子的非还原端水解α-1，4糖苷键，依次切下一个麦芽糖.不能水解α-1，6糖苷键水解产物糊精和麦芽糖.生产菌种:主要为芽孢杆菌、假单孢菌、放线菌等。葡萄糖淀粉酶:从淀粉分子的非还原端水解α-1，4糖苷键，依次切下一个葡萄糖,也能水解α-1，6糖苷键.生产菌种:主要为黑曲霉，水解产物葡萄糖异淀粉酶:水解支链淀粉的分支点的α-1，6糖苷键.生产菌种:主要为假单孢菌，水解淀粉的α-1，6糖苷键，与β-淀粉酶一起使用制造麦芽糖。淀粉酶在食品工业上的应用果葡糖浆的生产是一种果糖和葡萄糖为主要成分的混合糖浆。生产工艺：淀粉α-淀粉酶液化型淀粉葡萄糖淀粉酶糖化葡萄糖异构酶混合糖浆超高麦芽糖浆的生产工艺流程：淀粉α-淀粉酶液化型淀粉β-淀粉酶和异淀粉酶糖化脱色超高麦芽糖浆超高麦芽糖浆:麦芽糖含量达75%-85%以上的麦芽糖浆（二）发酵方法与发酵条件用于酶生产的发酵方法有：1、固体发酵法即以麸皮、米糠等为基本原料，加无机盐和适量水分(通常50％左右)进行的一种微生物培养法。用青霉、曲霉生产果胶酶；用木霉生产纤维素酶2、液体发酵法利用合成的液体培养基在发酵罐内进行搅拌通气培养，目前主要的方式。（1）间歇发酵法：特点：先在适于菌体生长条件下培养，然后再转入产酶条件下进行发酵。产酶量高，同时营养物质与诱导物浪费少。（2）连续发酵法：特点：先将菌体培养至某一生长期如对数期，然后一面连续加入新鲜培养液，另外又不断地以相同速度放出培养产物，二者的速度还应和生长速度一致，使菌体生长处于恒态条件，同时还可能打破酶合成的反馈阻遏，使产酶率提高。发酵条件既要有利菌体生长繁殖，又不影响酶的形成。影响发酵的条件：首先，培养基组成，其次，通风量、培养温度等因素（三）提高酶产量的方法在正常情况下，酶产量受其合成调节机制的调控，因此要提高酶产量就必须打破这种调控机制。酶合成调节控制能保证机体最经济有效地将体内原料和能量用于合成生命活动最需要的物质，但是人们为了需要使某些酶大量合成就必须打破这种调节机构。1、通过条件控制提高酶产量(1)添加诱导物:这种方法只适应于诱导酶的合成。其关键在于选择适宜的诱导物及其浓度。诱导物：一是酶的作用底物，但有些底物并不一定是诱导物；二是一些难以代谢的底物类似物。三是诱导物的前体物质。此外,对于参加分解代谢的胞外酶，它们的产物也往往行诱导作用，如纤维二糖诱导纤维素酶。(2)降低阻遏物浓度:对于受分解代谢产物阻遏的酶，常采用直接限制碳源或相应的生长因子供应。对于合成代谢的酶解决尾产物阻遏的方法在培养基中添加尾产物类似物或尾产物形成的抑制剂采用营养缺陷型菌株，限制其必须生长因子的供应阻遏有两种：分解代谢产物阻遏、尾产物阻遏分解代谢产物阻遏：当细胞在容易利用的碳源（葡萄糖）上生长时，有些酶特别是参与代谢的酶类的合成受阻。尾产物阻遏：有些酶当它们的作用产物积累到一定浓度，并满足集体需要后，其合成就受阻。2、通过基因突变提高酶产量根据酶合成的调节机构，要使酶产量因基因突变而提高，有两种可能：一是使诱导型变成组成型：即获得的突变株在没有诱导物存在的条件下酶产量达诱导的水平；二是使阻遏型变为去阻遏型：即获得的突变株在引起阻遏的条件下，酶产量达到无阻遏的水平。方法：物理：紫外线、X-射线化学：5-溴代尿嘧啶、亚硝酸等基因突变？基因重组？3、其他提高酶产量的方法(1)添加表面活性剂：人们发现许多表面活性剂能提高酶的产量，特别有利于霉菌胞外酶的生产，而且它们对菌和酶没有专一性，通常用的是非离子型表面活性剂如Tween80、TritomX-100等。目前认为，表面活性剂可能是提高了细胞膜的透性，有助于打破细胞内酶合成的“反馈平衡”。(2)其他产酶促进剂：有时添加其他一些物质也能提高酶的产量。如枯青霉培养基中添加植酸钙镁，可使5’-P-二酯酶产量增加10-20倍。(3)通过基因重组提高酶的产量：分离纯化酶时应注意的问题防止酶变性失活提高酶的纯度检测酶的活性二、酶的分离纯化酶的分离纯化包括三个基本的环节：抽提：即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；纯化：即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；制剂：即将酶制成各种剂型。第四节固定化酶从20世纪60年代起，固定化酶研究的发展很快。初期，人们集中于各种制备方法的研究，近年，人们的注意力已开始转向固定化酶和固定化细胞在工业、医学、化学分析、亲和层析和环境保护、能源开发以及理论研究等方面的应用研究。固定化酶：指经过一定改造后被限制在一定的空间内，能模拟体内酶的作用方式，并可反复连续地进行有效催化反应的酶。固定化酶又称固相酶。固定化技术：是