聚乙二醇在脂质体中的作用

聚乙二醇在脂质体中的作用2010/11/1/18:33兼有亲水性和柔顺性的聚乙二醇高分子．能在脂匝体表面形成一层水化膜，阻碍血浆成分与脂质体表面的吸附，从而降低网状内皮系统对脂质体的摄取，使脂匝体在体循环中的时间延长。本文从作用机理角度，综述聚乙二醇对脂质体及免疫脂质体的稳定性和药物动力学的影响，以及具在脂质体中的应用。聚己二醇脂质体免镀脂质体脂质体(Ls)和免疫脂质体(ILs)作为药物载体有许多优点，如易被生物降解，无毒，能提高药物治疗指数，降低药物毒副作用和减少用药剂量等。但传统脂质体(CLs)和免疫脂质体易被网状内皮系统(RES)的细胞识别并摄取，导致血循环半减期(t1/2)很短(通常低于30分钟)，到达靶器官之前即被清除，故应用很受限制。脂质体膜表面引入聚合物分子而形成的空间稳定脂质体(SLs)为脂质体的发展注入了新的活力，其中最常用的也是研究最多的聚合物分子是聚乙二醇(PEG)。PEG具有结构简单，价廉，无毒，无免疫原性和端羟基易于衍生化等优点。本文就PEG延长脂质体的血循环作用及其立体位阻影响因素，对脂质体渗漏的影响，被动靶向作用，在空间稳定免疫脂质体中的桥接作用及应用作一综述。1PEG对脂质体血循环的延时作用1．1PEG立体位阻一般认为，决定脂质体与RES产生亲和作用的是脂质体与RES细胞的非特异性疏水作用和一些血浆成分(主要是调理素，opsonin)对脂质体的特异性调理作用[1,2]。PEG的亲水性使其在脂质体表面形成一层水化膜，掩盖脂质体表面的疏水性结合位点，阻碍血浆成分接近脂质体，从而降低RES对脂质体的识别和摄取，延长脂质体的血循环时间[3，4]。单甲氧基聚乙二醇(MPEG5000)与预先制备好的脂质体膜中的二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)共价结合，制成SLs。后者在体外血浆中能稳定存在，其与血浆成分的吸附比不含MPEG的脂质体慢；体内研究表明，与末修饰的t1/2最长的脂质体相比，SLs的血循环清除可减慢30％[5]。补体介导的调理作用是荷电大粒径脂质体被清除的一条基本途径。在100nm的阴离子脂质体中，分别加入PEG600胆固醇，或PEG1000胆固醇、或PEG2000-磷脂酰乙醇胺，均有抑制Clq(其能识别IgG，IgM的补体结合点，启动补体经典激活途径)结合及补体活性的作用。当上述三种物质浓度分别为15.10和5mol％时，补体活性受抑制程度最大[6]。PEG同样能阻碍某些蛋白质的吸附和细胞粘附。使用Langmuir-Blodgett方法，把单层DPPE与不同摩尔百分比的DSPE-PEG(PEG750～5000)混合后，加入到DPPE覆盖的玻璃表面上，结果显示，随着PEG百分比增加，牛血清白蛋白(BSA)及海带氨酸(laminien)和纤连蛋白(fibronectin)吸附量明显减少；红细胞，淋巴细胞，巨噬细胞的粘附作用明显降低[7]。用流动单核吞噬细胞与脂质体于血浆中一起保温，表面含PEG的SLs，血浆白蛋白吸附减少，吞噬降低，血循环t1/2延长[4,8]。PEG分子量不同，链长不同，其立体位阻强弱不同，保护强度也不同。静注分别含有PEG750-磷脂酰乙醇胺，PEG2000-磷脂酰乙醇胺．PEG5000-磷脂酰乙醇胺的SLs，其血液t1/2依次为0．7，1.7和6．2小时，而不含PEG的脂质体t1/2仅为0．5小时[9]。1．2影响PEG立体位阻的因素1．2．1PEG亲水性单纯PEG2000，以任意线圈构象存在时，每个分子能结合136±4个水分子，而以Brush构象存在的DHP-PEG2000中的每个PEG2000分子能结合210±6个水分子。随PEG-脂质复合物浓度增加至约7mol％时，脂质体双分子层绝热压缩系数增加，提示脂质头基区水分子减少，使脂质体表层脂质双分子层缺如降低，磷脂酰基链侧面包蔽增加。PEG水合作用与脂质头基区去水合作用对含有5～7mol％PEG-脂质复合物的脂质体热力学稳定性均有正向作用，而当PEG-脂质复合物浓度更高时，由于PEG侧面排斥作用，脂质头基区水合增加，双分子层包蔽弱化，脂质体稳定性反而降低[10]。1，2．2PEG柔顺性脂质体表面包被亲水性的葡聚糖不能保护脂质体免受血浆成分作用，也不能使t1/2延长[8,11]。因此作为保护剂，单有亲水性还不够，柔顺性更重要，后者可使脂质体表面聚合物层出现一个构象云，使之在相对较低的浓度时也能阻止溶质渗透。该假说已使用高分子溶液的简单统计模型建立[12]，模型把高分子溶液视为一个三维网络，每格均被一个聚合单元或溶剂(水)分子所占据。聚合物分子柔顺性越好，聚合单元相对于邻近单元的运动就越独立，这样它可能构象的总数就越多，从一个构象转变为另一个构象的速率就越快，结果是水溶性使高分子所有可能的构象分布柔顺成为一种统计“云”而存在。高分子的柔顺性使其在溶液中占据许多格，可瞬时把水分子挤出，故使那些需要自由水分子进行扩散的溶质变得不可通透。因此，少量的具有水溶性和高柔顺性的聚合物分子就能在脂质体表面形成足够密的“构象云”，从而保护脂质体不受破坏或发生修饰作用。如果固定在脂质体上的聚合物有一刚性链，其可能构象很少，构象之间转变很慢，这就导致其“构象云”密度很低且不均匀，其在网络模型中，表现为存在足够多的水分子空间，使得血浆蛋白能扩散到达脂质体表面。Torchilin[11]应用计算机模拟方法，将固定在脂质体表面的聚合物空间分布用一个三维随机飞行模型来模拟．发展了柔顺性高分子在粒子表面的行为模型。假定聚合物由能围绕链段连接点自由转动且刚性的链段组成，其长度是柔顺型的5倍。计算机分析结果表明；柔顺型聚合物形成高密度“构象云”，而同样长度刚性聚合物则形成宽松可渗透“云”。该模型的另一结论是PEG在不饱和浓度时，脂质体表面可有两种反应活性中心，一种是未被PEG占据的部分，性质与CLs相似，另一种是被PEG占据的部分，其能阻碍修饰作用发生。这为在同一脂质体上连接不同功能基团奠定了基础。1．2，3PEG-脂质夏合物种类通常认为，脂质体的破坏是由于血液中高密度脂蛋白(HDL)把磷脂分子从双分子层中拖出来，破坏了脂质双分子层的紧密程度，使其通透性增加，导致脂质体包封物泄漏。单纯Me-PEG或PEG-硬脂酸不能降低RES对脂质体的摄取，因为这些化合物与脂质体连接很弱；PEG-二棕榈酰甘油酯和PEG-胆固醇使脂质体t1/2延长的作用大于Me-PEG和PEG-硬脂酸而小于DSPE-PEG．其较易被HDL从脂质体中转移或交换出来，或与PEG相连的键断裂，使PEG衍生物或PEG离开脂质体，导致脂质体被破坏而清除；DSPE-PEG有两个饱和脂酰基链．与脂质体连接最牢，保护作用最强[13]。脂质体组成为鞘磷脂(SM)：卵磷脂(PC)：胆固醇二1：1：1(摩尔比)，DSPE-PEG浓度为5~7mol％时，其血液循环t1／2最长。而单唾液酸神经节苷酯(GMI)要达到同样效果，需用10mol％浓度。与GMI相比，PEG除用量较少外，其优点还表现在：易于合成，无毒，无免疫原性，能使粒径范围较宽的脂质体的t1／2延长，且生物分布更广[14]，同时，DSPE-PEG适用于与高或低温相转变的磷脂配伍，而GMI只适用于高温相转变磷脂[15]。1．2．4PEG链长和浓度随PEG-磷脂酰乙醇胺浓度增加，PEG链加长．其抑制脂质体凝集程度也增大[9]。在10mol％时，PEG750-磷脂酰乙醇胺，PEG2000-磷脂酰乙醇胺，PEG5000-磷脂酰乙醇胺对脂质体凝集抑制程度分别为14％，55％和100％。当浓度处于0～10mol％时，PEG750-磷脂酰乙醇胺抑制RES搔取的作用呈线性增加，t1／2呈线性延长：而对PEG2000-磷脂酰乙醇胺和PEG5000-磷脂酰乙醇胺而言，当浓度增加到5mol％时，这种抑制作用达到坪期。脂质体凝聚结构从层状转变到胶束状会经历一个双层平盘中间态。一旦转变为开放结构，其药物包裹能力丧失。因此掺入到SLs中的PEG-脂质复合物的上限取决于形成双层平盘的浓度，而不是混合胶束形成的浓度，该点浓度受PEG链长和磷脂链长影响，而磷脂饱和度和胆固醇的存在与否并不影响[16]。2PEG对脂质体渗漏的影响渗漏率是评价脂质体性能的重要指标。脂质体渗漏率低意味着有尽可能多的药物被送到靶位。对含7mol％PEG-磷脂酰乙醇胺的EPC-胆固醇(摩尔比1：1)脂质体与单纯EPC-胆固醇(1：1)脂质体在磷酸盐缓冲液和90％血清中的稳定性进行比较，PEG-磷脂酰乙醇胺并不增加脂质体内容物的渗漏，包封的钙黄绿素在12小时内约有10％渗漏[17]。体内持续给予含DSPE-PEG的DSPC：DSPE-PEG(摩尔比9：1)脂质体，发现脂质体在血液中含量较高，t1／2超过20小时．药物渗漏率为每小时2．4％[4]。PEG与DSPE通过氨基甲酸酯键连接，在生理pH条件下，磷酸基部分带负电荷，因此含DSPE-PEG的SM-胆固醇脂质体中长春新碱体内渗漏较快；而PEG-酰基鞘氨醇呈电中性，没有表面电荷，其SM-胆固醇脂质体中长春新碱渗漏很慢，且酰基鞘氨醇的酰基链越长(C8～C24)，脂质体在血循环中的时间就越长，长春新碱血浆浓度就越高[18]。3PEG被动靶向作用经静脉注射后，不同分子量的PEG在肿瘤组织中的积聚程度不同，分子量增大，PEG在血液中停留时间延长，而在肿瘤组织的渗透速率却减慢。不论PEG分子量如何，以及肿瘤位于何种部位，PEG均表现出对肿瘤部位的高积聚性，停留时间也比在正常组织中长。另外，PEG对任何器官没有特殊亲和力，表明PEG与血浆成分等没有特异性作用[19]。因此SLs不会因PEG本身发生调理作用而被RES细胞摄取，而体内时间延长则能增加肿瘤组织的积聚，且由于肿瘤组织血管的高通透性而有较高的积聚速率，SLs这种靶向作用属于被动靶向作用。SLs在体内靠滤过作用到达肿瘤组织[20]。PEG-脂质复合物能增加SLs在肿瘤组织的积聚，载药SLs在肿瘤组织的聚集量是载药CLs的10倍[21]；包载金胶粒的SLs在C-26结肠癌模型的小鼠定位研究结果表明，金胶粒主要集中在肿瘤血管外的细胞间隙，并能到达深部空间，分散于整个肿瘤部位[22]。SL-DOX是一种阿霉素的SLs，其在治疗AIDS并发的卡波济肉瘤中疗效明显[23]。SL-DOX在卡波济肉瘤中的聚集量比直接给予游离DOX的聚集量高11．4倍。4PEG在空间稳定免疫脂质体中的桥接作用空间稳定免疫脂质体(SILs)兼有长循环t1/2和主动靶向作用，是一种很有应用前景的药物载体。SILs的性能，如抗体密度，靶向识别。循环t1/2，载药能力等，受诸如PEG，抗体(Ab)，脂质体大小和组成等因素影响。PEG是影响SILs循环t1/2的主要因素，也是影响其体内分布的重要因素。SILs在损伤部位分布取决于PEG和Ab．而损伤部位和正常部位分布比主要取决于Ab，也受PEG影响，加入PEG使SILs在正常组织中聚集增加，以致分布比减小[24]。PEG和Ab促进脂质体在损伤部位聚集是通过不同机理进行的，前者通过滤过作用，后者利用Ab与抗原特异结合，两者共同作用构成了SILs在损伤部位聚集。因此，根据使用目的，可以设计成具有较高靶位与非靶位聚集的各种比率的诊断用药物载体(Ab-脂质体)和具有较高的绝对靶位聚集率的治疗用药物载体(Ab-PEG-脂质体)。PEG和Ab在脂质体上有两种连接方式，一种是PEG和Ab都接在脂质体表面[25]，另一种是PEG一端接Ab，而另一端连在脂质体表面，起桥接作用。第一种连接方式中，PEG影响Ab识别能力。PEG浓度很低时，不能完全覆盖脂质体表面，接在脂质体表面的Ab不受PEG屏蔽，保持其靶向识别与结合能力，但此时脂质体清除也很快；PEG浓度较高时，PEG“构象云”相互交叠完全覆盖在脂质体表面，但仍有一些琉松构象云存在。Ab仍能与其靶抗原结合，且此时脂质体血循环时间也较长，这是一种较理想的情况；PEG浓度更高时，构象云拉伸，血循环t1／2大大延长，但同时从识别能力也被屏蔽[26]。因此，这种结合方式中的PEG链长和