聚合物在生物大分子分离中的应用2014

中国科学技术大学高分子科学与工程系王延梅E-mail:[e-mail].0551-63607652聚合物在生物高分子分离中的应用1.分离过程及原理2.聚合物在DNA分离中的应用3.聚合物在蛋白质分离中的应用内容1.分离过程及原理定义：将一定样品中相关的化学物质拆解成纯的物质称为分离。方法：萃取、过滤、离心、色谱、电泳等。实质：混合的逆过程。混合是自发的，分离是被动的，需要能量或外力的推动。原理：差速运动过程，即利用速度差别进行物质的分离与纯化，电泳：带电粒子在电场作用下于一定介质（溶剂）中所发生的运动。电泳分离及其条件选择的依据：离子所带电荷越多、解离度越大、体积越小、溶液的黏度越小，电泳速度越快。电渗：毛细管中的溶剂因轴向直流电场作用而发生的定向流动，起因于定域电荷。定域电荷：牢固结合在管壁上、在电场作用下不能迁移的离子或带电基团。电渗的方向：与固体表面电荷所具有的电泳方向相反；电渗的强度:与定域离子的数量或固液界面成正比；与流路通道孔径有关。熔融硅毛细管中的电渗定域电荷产生指向负极的电渗CE工作原理例：当把样品从正极端注入到石英毛细管中时，不同符号的离子将按表中的速度向负极迁移。组分合淌度合速度正离子中性分子负离子osemHosemHvvvosHosHvvemosHemosHvvvEvem/os电渗率：电迁移率：2．聚合物在DNA分离中的应用人类基因组计划（HumanGenomeProject－HGP）1986年，著名生物学家、诺贝尔奖获得者H.Dulbecco提出人类基因组计划。1990年正式启动，其主要目标有：识别人类DNA中所有基因（超过10万个）；测定组成人类DNA的30亿碱基对的序列；将这些信息储存到数据库中；开发出有关数据分析工具；致力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。遗传学核酸(DNA和RNA)的功能：储存和传递信息，指导和控制蛋白质的合成。DNA:主要的遗传物质，通过复制而将信息由亲代传给子代。RNA:与遗传信息在子代的表达有关。刑侦学腺嘌呤(A)鸟嘌呤(G)胸腺嘧啶(T)胞嘧啶(C)DNA的组成DNA的结构毛细管电泳分离DNA的过程电渗是CE的基本现象之一，它可以控制组分的迁移速度和方向，进而影响CE的分离效率和重现性．DNA的分离理论310型全自动遗传分析仪ABIPrism®3100遗传分析仪DNA分析仪ABI310-DNA中的染料如何控制电渗流？理论：能影响电渗的因素都有可能用于电渗的控制实际：能理想地调节电渗而又不影响分离过程的控制方法目前不多见．对于DNA分离及测序来说，pH-8.3，常用管壁涂层（涂覆)技术.用于DNA分离的聚合物交联聚合物非交联聚合物筛分介质：凝胶和非凝胶(非交联的聚合物溶液)。要求：低黏度、高的筛分能力和自涂覆功能。非凝胶：均聚物、共聚物（包括无规、嵌段、接枝等）、共混物等。均聚物线形聚丙烯酰胺聚N,N-二甲基丙烯酰胺聚氧化乙烯羟乙基纤维素聚乙烯基吡咯烷酮存在的问题：共聚物a.无规共聚物poly(DEA-co-DMA)聚(N,N-二乙基丙烯酰胺-co-N,N-二甲基丙烯酰胺）poly(AM-co-DMA)聚(丙烯酰胺-co-N,N-二甲基丙烯酰胺)poly(AA-co-AG)聚(丙烯酰胺-co-β-吡喃型葡萄糖)poly(AM-co-AAG)聚(丙烯酰胺-co-葡糖酰丙胺)poly(NEEA-co-NMEA)聚(乙氧基乙基丙烯酰胺-co-乙氧基甲基丙烯酰胺)等b.嵌段共聚物PEG-(CnF2n+1)2末端带有碳氟化合物的聚乙二醇PEO-PPO-PEO低分子量的聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的三嵌段共聚物BEB/EBE聚环氧乙烷和聚环氧丁烷的三嵌段共聚物等C.接枝共聚物PAM-g-PNIPAM（聚丙烯酰胺-g-聚N-异丙基丙烯酰胺)PNIPAM-g-PEO(聚N-异丙基丙烯酰胺-g-聚环氧乙烷)PAM-g-PDMA（聚丙烯酰胺-g-聚N，N-二甲基丙烯酰胺）PDMA-g-PMMA（聚N，N-二甲基丙烯酰胺-g-聚甲基丙烯酸甲酯）等存在的问题：共混聚合物•不同分子量的PEO分离ds和ssDNA•HEC，LPA等不同分子量的混合物也都能成功地对DNA分离或排序存在的问题：线形聚丙烯酰胺（LPA，高分子量)：优点：测序功能优异，如DNA读取长度缺点：高黏度、无自涂覆能力聚N,N-二甲基丙烯酰胺（PDMA):优点：优异的自涂覆功能、低黏度缺点：测序功能不如LPA很少有均聚物能同时满足以上要求。准互穿网络聚合物(quasi-IPN)(1)PVP和PDMA组成的quasi-IPN分离双链DNA(ds-DNA)4%PVP均聚物+4%PDMA均聚物Quasi-IPN(4%PVP+4%PDMA)PVP、PDMA、它们的共混物、quasi-IPN形成网络的原理Quasi-IPN重现性的研究Electrophoresis2002,23,1460-1466MMRMMMMMMMMMMRMRMMMMMMMMM(2)PAM和PDMA组成的quasi-IPN在DNA测序中的应用反相微乳液聚合合成PAM18192021222302x1064x1062502001501005024252627282902x1064x10640035030030313233343502x1065505004503637383940414201x1062x10675070065060043444546474801x1062x106850800migrationtime,minElectrophoresis2005,26,126-136PAM/PDMA组成的quasi-IPN用于DNA测序不足之处：quasi-IPNGNPsquasi-IPN/GNPsDMAinitiatorquasi-IPNLPA(3)quasi-IPN/GNPs复合介质TEMimagesof(A)GNPs20(~20nm),(B)GNPs40(~40nm),and(C)GNPs60(~60nm)inwater,and(D)GNPs40(~40nm)inquasi-IPN3polymersolution.1214161820222426283032200040006000121416182022242628303220004000600012141618202224262830322000400060001214161820222426283032200040006000365218Migrationtime(min)Blue,G358210Green,A301Yellow,T356207FluorescenceintensityRed,CThepartialfour-color(baseC,T,A,G)electropherogramsofstandardDNAsampleusing2.5%w/vquasi-IPN3/GNPs40-1byCEat50℃.Electrophoresis,2007,28,1072-1080.Electrophoresis,2007,28,2998-3007中国发明专利：ZL200610114099.3.(4)quasi-IPN/官能化金纳米粒子复合介质Theschematicrepresentationofreactionroutesfor(A)GNP-PDMAand(B)quasi-IPN/GNP-PDMA.(A1)GNPs(~18nm);(A2)GNP-PDMA;(B1)freshGNPsolution;(B2)GNPsolutionafter2months,(B3)GNP-PDMAsolutionafter10months.1)HNO3COOHCOOH2)SOCl23)HOCH2CH2OHBrBrO4)COOCH2CH2OOCCBrCH3CH3COOCH2CH2OOCCBrCH3CH3COOCH2CH2OOCCCH3CH3CH2CHBrmC=ONH3CCH3COOCH2CH2OOCCCH3CH3CH2CHBrmC=ONH3CCH3DMACuBrMe6[14]aneN4MWNTMWNT-COOHMWNT-BrMWNT-PDMAElectrophoresis,2008,29,4637-4645+MWNT-PDMAquasi-IPNquasi-IPN/MWNT-PDMAdouble-networkmatrix(5)quasi-IPN/官能化的多壁碳纳米管双网络复合介质020040060080010000.40.60.81.01.21.4ResolutionBasenumberquasi-IPN(2.5%)quasi-IPN/MWNT-PDMA2(2.0%+0.038mg/mL)quasi-IPN/MWNT-PDMA2(2.5%+0.038mg/mL)quasi-IPN-H(2.5%)POP-6小结•将GNPs加入到由较低分子量的LPA和PDMA组成的quasi-IPN中，形成了quasi-IPN/GNPs。quasi-IPN/GNPs的测序时间不仅小于quasi-IPN，而且分离度也高于quasi-IPN，接近甚至高于含较高分子量LPA但不含GNPs的quasi-IPN。•将GNP-PDMA加入到由较低分子量LPA和PDMA所组成的quasi-IPN中得到quasi-IPN/GNP-PDMA.。GNP-PDMA的存在可以改善GNPs与整个测序体系的相容性、增大网络的缠结程度并增加GNPs在体系中的含量，从而导致整个筛分网络更加受限和稳固、介质的表观分子量更高并且孔径更小，因此与之前的quasi-IPN/GNPs相比，quasi-IPN/GNP-PDMA可以进一步增强ssDNA的测序性能。•通过原子转移自由基聚合法（ATRP）制备了PDMA官能化的多壁碳纳米管（MWNT-PDMA）添加剂，并加入到由LPA（3.3MDa）和PDMA所组成的quasi-IPN中而得到了聚合物/纳米管双网络复合筛分介质（quasi-IPN/MWNT-PDMA）。柔性的quasi-IPN聚合物网络和刚性的MWNTs（具有独特的管状结构）网络相互作用，从而避免聚合物之间彼此滑移、稳固和制约总的筛分网络、增加介质的表观分子量并减小介质的孔径。因此，quasi-IPN/MWNT-PDMA介质中的这种更受限、更稳固且孔径更小的纳米结构使得测序性能更优良。２．聚合物在蛋白质分离中的应用后基因组时代（Post-GenomeEra)科学的发展以及技术上的突破，使人类基因组计划一再提前，生命科学已经进入了后基因组时代，科学家们的研究重心已从揭示基因组DNA的序列转移到在整体水平上对基因组功能的研究。后基因组时代的一个重要标志就是蛋白质组学（Proteomics)的建立。在蛋白质组学中，蛋白质分离分析的重要性及意义也日见突出。2001，人类蛋白质组计划(HumanProteomeProject,HPP)蛋白质是由氨基酸通过酰胺键连接而成的高分子，两性，存在等电点，因其空间结构的复杂性，有亲水或疏水之分。蛋白质是基因表达的最终产物，是细胞结构的组成成分，生命现象中绝大多数生物功能是通过蛋白质来实现的。蝴蝶从卵变虫变蛹再变蝶，是个绝对神奇的过程。基因只是遗传信息的载体，要研究生命现象，诠释生命活动的规律，只了解基因组的结构是远远不够的，必须对基因的编码产物-蛋白质进行系统深入的研究。HumanBrainProject蛋白质和疾病阿尔茨海默病（Alzheimerdisease，AD）与tau蛋白：在AD患者脑内，发病机制很多，其中一种观点认为因Tau蛋白异常过度磷酸化，并聚集成双螺旋丝形式，与微管蛋白的结合力降低，失去了促进微管形成和维持微管稳定的作用。异常磷酸化Tau蛋白的病理性沉积，导致了神经原纤维缠结（NFTs）的形成。•蛋白质在低于等电点时会带上正电荷，在高于等电点时带负电荷．•若缓冲溶液的pH值低于蛋白质等电点，蛋白质则吸附H＋而带正电荷，由于静电相互作用，蛋白质与管壁发生吸附。碱性