肝母细胞瘤相关遗传变异及生物标记物

肝母细胞瘤相关遗传变异及生物标记物肝母细胞瘤（hepatoblastoma，HB）是小儿最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，也是继神经母细胞瘤和肾母细胞瘤之后的小儿第三大常见的腹部恶性肿瘤[1]。14％的肝母细胞瘤见于新生儿，68％发生于2岁以内，90％发生于5岁以内。仅有3％的患者＞15岁。男性患病比例略高，1.5∶1～2∶1，但没有种族倾向。常见的临床表现有腹部膨隆、腹块、腹痛等。70%的患儿有血甲胎蛋白水平升高。手术和化疗是目前主要治疗措施。上世纪80年代以前，肝母细胞瘤的治愈率仅为30%。近年来，随着研究的深入和综合治疗的应用，肝母细胞瘤的治愈率已达到70%以上。尽管如此，肝母细胞瘤的病死率仍高达20～30%。最近通过基础与临床研究确定了许多与肝母细胞瘤相关的遗传学及生物学标记,这些标记的获得可以帮助筛选病人,早期诊断,预测预后和对肿瘤分层,从而进行适当的治疗。许多预后研究也已经确定多种肿瘤标记物与肝母细胞瘤的总体生存率及无瘤生存率有关。然而,目前很难确定哪一种标记物最有效,这也表明了肿瘤复杂的本性以及尚缺少大样本的临床研究。现查阅近15年国内外肝母细胞瘤研究文献，对与肝母细胞瘤筛查、诊断、预后及监测相关的部分遗传及生物标记物进行综述。一、染色体变异随着肝母细胞瘤相关染色体及基因研究不断进步。研究者们发现了许多染色体的变异。在染色体的变异中染色体的获得多于染色体的丢失[2].其中最常见的变异为2、8和20号染色体的三体性。目前染色体杂交技术使研究者能够进一步的准确确定染色体的变异，并且能够定位肝母细胞瘤相关的基因片段。随着人类基因组计划的完成研究者利用基因芯片技术发现了许多染色体区域的变异，染色体2q13-22,2q36-37的获得以及2p和4q的丢失都与晚期的肿瘤及不良的预后相关[2-3].研究者还发现染色体1p32,1p36.3,以及11p15.5杂合性的丢失，其中后者与Beckwith–WiedemannSyndrome关系密切，并且导致抑癌基因H19的丢失及胰岛素样生长因子-2(IGF-2)的两个等位基因的激活[2].高红等通过比较基因组杂交(CGH)技术，对30例HB中染色体1p36上6个微卫星的杂合子丢失进行检测，结果每例HB细胞染色体均有不同程度的变异，30例HB中1号染色体上6个基因座发生LOH的总频率为63．3％，其中D1S199为最高，其次为D1S450。此研究认为HB存在多条染色体DNA拷贝数扩增或丢失的区域；HB在染色体1P36上存在广泛的LOH；染色体变异引起相应瘤基因扩增和抑癌基因的丢失可能参与了HB的发生、发展[4].二、原癌基因及抑癌基因基因突变主要是某些原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及凋亡相关基因的改变，这些改变导致细胞的增殖分化和凋亡失调最终导致肿瘤的发生。抑癌基因根据功能可分为控制细胞增生的看门基因(Gatekeepergene)和维持基因完整的看管基因(Caretakergene)。几乎一半的人类肿瘤均存在抑癌基因的失活，可见抑癌基因的失活与肿瘤的生长有着密切的关系。目前研究较多的常见抑癌基因包括P53、Rb、APC、DDC等。肿瘤抑制基因P53是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，是目前研究最广泛和深入的抑癌基因。其正常功能的丧失，最主要的方式是基因突变。由于P53基因点突变，直接的后果是导致氨基酸的改变，最终产生没有活性的P53蛋白，失去抑癌作用。由于人类恶性肿瘤P53基因突变率较高，P53基因的研究及治疗肿瘤就自然成了研究的热点。推测突变型P53基因蛋白致癌作用是通过抑制细胞凋亡来实现的。另外近年发现Bcl-2可抑制各种组织的细胞凋亡，是目前公认的抗凋亡基因［5-6］。周建斌、李代强等应用原位末端标记及免疫组化技术检测肝母细胞瘤中细胞凋亡及增殖细胞核抗原(PCNA)，P53和Bcl-2蛋白表达，通过与对照组对比研究，得出突变型P53及Bc1-2蛋白均具有抑制细胞凋亡，促进细胞增殖的作用［7］。其他研究，胡友主通过过氧化物酶标记的链霉卵白素方法表面，抑凋亡基因Bcl-2在肝母细胞瘤及小儿正常肝组织中均无表达，P53在肝母细胞瘤中表达阳性率为69．2%，在小儿正常肝组织中无表达(P＜0.01);P53的阳性表达水平，临床分期越晚则越高(P＜0.01);胚胎型组高于胎儿型组［8］。证实肝母细胞瘤的发生与P53蛋白异常表达有关，与Bc1-2表达无关。可以通过肝母细胞瘤测定P53表达判断预后。肝母细胞凋亡与增殖平衡调控异常在肝母瘤的发生、发展中可能起重要作用，突变型P53及Bc1-2蛋白均具有抑制细胞凋亡，促进细胞增殖的作用。研究人员还发现P53与增殖细胞核抗原(PCNA)表达之间存在着一种正相关关系，都与肿瘤的预后等因素有关。针对上述研究引入P53基因体内体外实验均表明确实可以抑制肿瘤细胞的生长，诱导其出现凋亡。将正常的抑癌基因导入肿瘤细胞中，以补偿和代替突变或缺失的抑癌基因，达到抑制肿瘤的生长或逆转其表型的抑癌基因治疗。RECK基因是近年发现的新型基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂，研究表明，其可在转录后水平抑制多种MMP的表达，抑制肿瘤血管形成，从而抑制肿瘤的侵袭及转移。研究表明，在9号染色体短臂上，特别是RECK基因定位的9P13～P12区域上的基因［9-11］，与许多肿瘤的发生、发展密切相关，这些肿瘤包括肺癌、肝细胞癌、头颈部鳞状细胞癌和膀胱移行细胞癌等。基质金属蛋白酶(matrixmeta-lloproteinases，MMPs)是自然界进化中高度保守的一类酶，其广泛分布于植物、脊椎动物、无脊椎动物中，MMP对ECM的降解是肿瘤细胞侵袭和转移的关键环节之一，多种恶性肿瘤都伴有MMPs分泌水平和活性的增高。在正常稳定状态下，组织中MMP的表达量极少，而在炎性细胞因子、激素、生长因子刺激和细胞转化过程中其表达量明显升高。此过程涉及人体多种生理及病理过程，如炎症、胚胎发生、血管形成、肿瘤侵袭转移等。其中MMP在肿瘤侵袭转移中作用机制的研究较多，有研究表明，在肿瘤组织中，其多种MMP的表达均明显升高，MMP与多种肿瘤侵袭转移的能力呈明显正相关。因此，关于MMP及其抑制剂的研究方兴未艾。RECK蛋白、膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)同样在肝母细胞瘤组织中的表达及其在肿瘤转移抑制中的作用。孙建等通过免疫组织化学方法检测35例肝母细胞瘤组织和15例正常肝脏组织及10例肝脏良性肿瘤组织中RECK、MT1-MMP的表达情况。结果发现肝母细胞瘤组织RECK的表达水平明显降低，MT1-MMP肝母细胞瘤组织中高表达，并随着肿瘤浸润深度的加深、远处转移的发生而增高；二者表达呈负相关。RECK和MT1-MMP在肝母细胞瘤组织中的表达呈负相关；RECK和MT1-MMP在肝母细胞瘤的进展中起重要作用。免疫组织化学方法检测35例肝母细胞瘤组织和15例正常肝脏组织及10例肝脏良性肿瘤组织中RECK、MT1-MMP的表达情况。结果：肝母细胞瘤组织RECK的表达水平明显降低；MT1-MMP肝母细胞瘤组织中高表达，并随着肿瘤浸润深度的加深、远处转移的发生而增高；二者表达呈负相关。表明RECK在肝母细胞瘤组织中表达随着肿瘤浸润程度的增加而下调［12］。说明MT1－MMP在肝母细胞瘤组织中高表达，并随着肿瘤浸润和转移的发生而增高。肝母细胞瘤组织中RECK和MT1－MMP的表达呈负相关，RECK蛋白的表达对肝母细胞瘤的侵袭转移可能有抑制作用，该作用可能与降低MTI－MMP蛋白的表达有关。许多细胞癌基因实际上就是具有启动子特异性的转录因子,通过与基因启动子区域的特异序列结合的方式调节基因,影响细胞生长、分化和凋亡。C-myc是具有439个氨基酸的核蛋白,是人们发现较早的原癌基因之一,也是与人类肝脏肿瘤最相关的基因。它属于具有DNA结合功能的转录因子,在细胞增殖过程中起重要作用[13]。人类多肿瘤中发现C-myc基因异常扩增,被认为与肿瘤发生有关,并把它作为肿瘤与非肿瘤的标志及肿瘤分级、分期的敏感指标。PCNA发现于1978年,是相对分子质量为36000的酸性蛋白,为DNA合成不可缺少的因子,也是一种细胞周期调节蛋白,其表达随细胞周期而变化,在G1期开始上升,S期达高峰,PCNA常作为测定细胞增殖水平的指标之一。PCNA过度表达是肿瘤生长快、侵袭力强及病人预后差的指标。华尧楷等发现HB组织内C-myc癌基因激活和异常扩增,使肝细胞获得增殖和分裂优势,这种组织学上细胞增殖分化异常,不但与HB的发生、发展有密切关系,而且与肿瘤的临床分期和预后有关。此研究还显示PCNA阳性表达与HB演进的一致性及与C-myc阳性表达的相关性和协同性,说明肝母细胞瘤的发生和发展是多因素、多步骤作用的结果。C-myc及PCNA表达与HB的临床病理指标密切相关,检测HB中C-myc及PCNA对估计肿瘤恶性程度,判断预后及指导治疗有重要意义[14]。近年来,在肿瘤发生的癌基因研究中,普遍认为肿瘤的发生、发展各阶段至少有两个以上异常激活的癌基因各自发挥不同作用,并且相互配合,协调了细胞的癌变。三、分子生物标记在肝母细胞瘤的研究中研究者发现了多种蛋白质分子的质量异常。血清AFP是在人体胚胎时期血液中含有的一种特殊蛋白质,主要由胎儿肝脏和卵黄囊产生。作为肝母细胞的肿瘤标志物,诊断时90％患者AFP水平的升高，AFP不但在初诊时有重要的预后意义,而且在整个肝母细胞瘤的治疗过程中始终是患儿预后情况及疗效的重要观测指标[15]。AFP水平与疾病过程平行，当肿瘤完全切除时AFP降至正常而随病变复发AFP水平升高。早期AFP水平较低的患儿预后可能更差[16]。另外目前有数个与胚胎发育有关的分子信号途径改变在肝母细胞瘤细胞中被发现。其中WNT途径在许多肝母细胞瘤中被激活，从而导致β-连环蛋白的稳定产生，这种蛋白能够聚集在肿瘤细胞的细胞核内并且使几种与细胞增殖相关的基因活化，例如myc和cyclinD1。WNT途径激活可以是β-连环蛋白变异导致的，也可能是由其他的重要分子途径变异导致，例如APC基因（在患家族性腺息肉病的病人中），AXIN1，conduction(AXIN2)。在很大一部分肝母细胞瘤病人中还有hedgehog信号途径的激活，高水平的mRNA和蛋白水平被发现，以及下游的GLI1（胶质瘤相关癌基因1），BCL-2（凋亡抑制基因）、PTCH。随着一些肝母细胞瘤中负调节蛋白低表达的发现，可以在这些肿瘤中发现HH信号途径的自分泌激活[17]。在免疫组化上，最近发现了HH途径成员SmoandGli1（胶质瘤相关癌基因1）的表达程度与患儿肿瘤的分级、大小及预后有着密切的联系[18]。IGF-2/H19遗传性的或者后的天突变主要出现在11p15.5上，这个突变导致IGF-2的过度表达，在大部分肝母细胞瘤中再次导致IGF/Pi3K／AKT通路的激活[17]。IGF下游的AKTandmammaliantargetofrapamycin（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）在这些肿瘤中强烈表达并有较强的活性，这些肿瘤靠这种激活途径长期存活。肝细胞生长因子(HGF)能够刺激数种不同的细胞活动，例如生长、侵犯、细胞运动性、细胞分化及血管生成等。HGF在胚胎发育期及伤口愈合剂器官再生时表现活跃，HGF／e-met信号传导主要存在以下几种通路：PI3K/AKT通路和细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivateduroteinkinase，MAPK)通路.肝母细胞瘤病人表现HGF的高表达，即便是在行肿瘤切除术后仍可出现，它能促进肿瘤细胞的转移、侵犯周围组织和寿命延长。另外最近研究发现一种在成人许多肿瘤中高表达的酪氨酸激酶受体（receptortyrosinekinaseerbB2）在许多肝母细胞瘤中也呈现出过度表达，也可能对这个肿瘤的发生发展有重要意义[19]。最近的实验室研究证明Notch信号通路[20]（一个高度保守的细胞间信号调节传导系统，它通过特异的信号上下级联作用影响细胞的增殖，分化和凋亡）、serpinB3分子[21]及microRNA-492（微小RNAs）[