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本章内容第一节、常用的工业微生物第二节、发酵工业菌种的分离筛选第三节、发酵工业菌种的鉴定和保藏第四节、发酵工业菌种的育种第一节最常用的工业微生物一、细菌醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌乳酸杆菌枯草杆菌丙酮丁醇梭菌大肠杆菌谷氨酸棒状杆菌生产各种酶制剂、有机酸、氨基酸、肌苷酸等二、放线菌链霉菌属小单孢菌属地中海诺卡氏菌米苏里游动放线菌生产多种抗生素（60%以上）三、酵母菌酿酒酵母假丝酵母属产朊假丝酵母解脂假丝酵母热带假丝酵母毕赤酵母属、汉逊酵母属用于酿酒、制造面包、生产脂肪酸、生产可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。四、霉菌曲霉属米曲霉黑曲霉青霉属青霉菌：点青霉、产黄青霉桔青霉根霉属德氏根霉米根霉、小麦曲根霉红曲霉属紫红曲霉生产酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等五、未培养微生物定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为99％。研究方法模拟自然培养法:模拟微生物生长的自然环境对未培养微生物进行可培养研究。原位培养、培养条件优化、单细胞微操作宏基因组分析法：直接依据基因或基因组、蛋白质序列及其调控表达机制构建高效表达的工程菌等途径进行开发利用。即通过未培养微生物的宏基因组分析来利用未培养微生物的基因资源。第二节发酵工业菌种分离和筛选一、菌种的来源根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。从自然界筛选制定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。预处理：提高菌种分离的效率富集培养：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：利用分离技术得到纯种。菌种的筛选：通过常规生产性能测定，进一步筛选产物合成能力较高的菌株。发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。菌种保藏二、新种分离与筛选的步骤1.采样（1）采样原则广泛性充分了解目标微生物的性质（种类、生理特征等）如根据微生物的营养类型：纤维素酶产生菌——森林土壤蛋白酶和脂肪酶产生菌——肉类加工厂和饭店潲水沟中的污水、污泥利用碳氢化合物为碳源的菌株——油田附近极端菌的筛选要根据其特殊的生理特征：高温酶产生菌——南方、温泉、火山爆发处及北方的肥堆耐压菌——油井或海洋深处（有机质丰富、通气保水性能好）(2)采样对象土壤、水、空气及枯枝落叶等，以土壤为主。从土壤中采样要考虑土壤的以下特点：①有机质含量和通风状况耕地、菜园山坡上的森林沙土、无植被土壤、新开垦的生土、贫瘠的土地②取样的土层深度：5-25cm——细菌、放线菌（有机质丰富、阴暗潮湿）——霉菌、酵母菌——微生物少1.采样1.采样③土壤的酸碱度偏碱——细菌、放线菌偏酸——霉菌、酵母菌④土壤的植被状况葡萄成熟时——根部酵母菌增多⑤地理条件南方土壤比北方土壤微生物含量多⑤季节条件秋季菜土样最理想2.样品的预处理（1）物理方法热处理：根据目的菌较非目的菌的耐热性高从而增加目的菌的比例。膜过滤法：浓缩水中的微生物细胞。离心法：同上。（2）化学法通过培养基中添加某些化学成分来增加微生物的数量。如：用添加CaCO3稳定培养基的PH来分离嗜碱性的放线菌。（3）诱饵法将某些固体物质如石蜡、花粉、蛇皮、毛发等加到分离的土壤或水中做成诱饵富集目的菌，待菌落长出后再进行分离。3.富集培养富集培养利用不同微生物生长繁殖对环境和营养的不同要求，如温度、PH、渗透压、溶氧浓度、碳源和氮源类型及浓度等，使目的微生物在最适宜条件下迅速繁殖，数量增加，成为人工环境下的优势种。3.富集培养富集培养的策略（1）控制培养基的营养成分用促进某特定微生物生长繁殖的选择性培养基或培养条件。可用抑制其他微生物生长繁殖的选择性培养基或培养条件。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。3.富集培养富集培养的策略（2）控制培养条件溶氧浓度——好氧/厌氧高温——嗜热微生物/非嗜热微生物PH——嗜酸性/嗜碱性4.菌种分离平板划线分离法稀释分离法毛细管分离法小滴分离法稀释分离法•稀释倒平板法•平板涂布法注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。•划线分离法——平板划线法分离方法的选择根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法菌种的营养特征独特生长特征独特无选择性特征根据产物的特征进行随机分离选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控制，从而实现定向富集筛选。选择性分离自然界中细菌的分离(一)采样和采集方法为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。采样的注意事项1、采样时应尽可能保持相对无菌；2、所采集的样本必须具有某种代表性；3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。1．土样采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面5～15cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分上却为根际土样。2．植物体采集方法在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土样一起保存。3．水样采集方法用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4℃下贮存。(二)生态学参数及培养基的组成原则1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。2、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必须含有10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物，部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤维素或果胶。3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素)，掺加浓度一般为50μg／m1，以抑制真菌的生长。4、琼脂平板在使用前应置于37℃培养箱中孵育l、2天。5、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。土中细菌的富集培养与分离分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集。但对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技术才能很好地被分离培养。富集方法运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富集技术。富集可以促进抗性的产生并维持下来。土样中细菌的富集：适度稀释后，取0.1m1涂布已添加及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等)的土浸出汁平板。植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂布平板。水中细菌的分离：水样通过0.22μm无菌滤膜，取出滤膜用1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。用样本稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤纸压印分离法。水中细菌分离的简易富集技术在无菌的、用棉团塞好的广口三角烧瓶中连续培养，定期取样涂布适宜分离琼脂平板上；在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白质等，同样可以促进水中微生物的增殖。培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如无菌的植物组织或土壤浸出液。通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、中温菌和嗜高温菌。次代培养及纯化步骤1、涂布的平板经培养后，如生长出菌落，则按涂布不同稀释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落对琼脂平板进行分类。2、用无菌牙签将菌落转接到筛选平板上及转接至添加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。3、筛选平板经培养后，按生长出菌落的形态学特征如色素、菌落形态等进行最初分组。4、将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟分离琼脂平板上进行筛选。细菌分离：以乳酸菌为例放线菌的分离(一)采样菜园土或林地土自然风干，备用土壤中放线菌最丰富，品种齐全。可以筛选新的放线菌。从堆肥或过热的材料中如干草或蔗渣中可分离到大量的嗜热放线菌，从淡水和海洋环境中分离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。气生孢子能耐干燥，耐湿热能力高于营养体，室温保存20天，放线菌的数量和组成变化不大，细菌大部分死亡。（1）取体积为300ml的高氏一号培养基，加入0.1%的重铬酸钾15mL，使之终浓度为50ppm，摇匀，倒平板，待用。（2）取土样5g，摊平于大号培养皿上，在恒温干燥箱中120℃干热处理1h。（3）土样热处理后，加入装有45mL无菌水和少量玻璃珠的三角瓶中，加入0.5mL的笨酚，室温下振荡30分钟，静止5分钟，取上清液用无菌水稀释10倍。同时另取土样5g，不加热和笨酚处理，余步骤同上，作为对照。（4）用移液管分别吸取原液和10倍稀释液各0.1ml标志稀释倍数的平板上，涂抹均匀，倒置，28℃培养。（5）培养10~14d，观察比较不同处理方法的生长情况、菌落特征。挑取红色，无气生菌丝的小菌落以及其它菌落形态菌株接种斜面，进一步用于形态观察和鉴定。放线菌分离操作步骤培养基添加重铬酸钾的方法减少细菌和真菌的数量用干热和苯酚处理减少链霉菌数量真菌分离真菌分离1、利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁涉生长。2、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。3、有时真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养时应加以考虑。4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。5、选择性抑制培养基可使非目标微生物消除或减少到一定程度。在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。真菌的分离方法土中真菌的分离：稀释法，混入法，压贴法，粘附法，浮选法，注射器采集法，土过筛法，庶糖密度梯度离心法。植物材料中真菌的分离：植入法，压贴法，洗涤法，浸泡法。水中真菌的分离：水样稀释后涂布分离。饵诱技术常用于水中真菌的富集。子实体直接分离培养担子菌：新采集的子实体组织植入平板内或在放于液体培养基表面放一小块无菌滤纸上培养。真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7稀释分离法取0.1ml加入固体培养基铺平皿（×2）在麦芽汁固体培养基