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肺癌细胞抑癌蛋白ＰＴＥＮ下调机制的研究时婧，高丰厚，郭跃辉，袁海花，姜斌上海交通大学医学院附属第三人民医院肿瘤科，上海２０１９００【摘要】目的：探讨肺癌细胞中抑癌蛋白ＰＴＥＮ低表达的相关机制。方法：Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法检测肺癌细胞和正常人肺上皮细胞ＢＥＡＳ－２ＢＰＴＥＮ蛋白的表达；用放线菌酮（１μｇ／ｍＬ）处理人肺腺癌细胞Ａ５４９和正常人肺上皮细胞ＢＥＡＳ－２Ｂ阻断细胞翻译后，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法检测不同时相ＰＴＥＮ蛋白的表达。ＲＴ－ＰＣＲ检测肺癌细胞与正常肺上皮细胞ＰＴＥＮｍＲＮＡ水平；放线菌素Ｄ（１μｇ／ｍＬ）处理肺癌细胞与正常肺上皮细胞阻断新生ＲＮＡ合成，ＲＴ－ＰＣＲ检测不同时相ＰＴＥＮｍＲＮＡ的水平。结果：Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示，肺癌细胞中ＰＴＥＮ蛋白表达与正常肺上皮细胞比较有不同程度的降低（０．３８～１．３２倍）；使用放线菌酮处理Ａ５４９和ＢＥＡＳ－２Ｂ后，２４ｈ内Ａ５４９及ＢＥＡＳ－２Ｂ细胞ＰＴＥＮ蛋白表达无明显改变。ＲＴ－ＰＣＲ结果显示肺癌细胞中ＰＴＥＮｍＲＮＡ与正常人肺上皮细胞相比明显降低（０．４１～０．６８倍）；放线菌素Ｄ处理显示肺癌细胞ＰＴＥＮｍＲＮＡ降解速率比正常肺上皮细胞降解速率明显加快。结论：肺癌细胞中抑癌蛋白ＰＴＥＮ低表达的主要原因是其ｍＲＮＡ降解加速，这为进一步研究ＰＴＥＮ蛋白低表达的详细分子机制提供了线索。中华肿瘤防治杂志，２０１２，１９（６）：４１９－４２２【关键词】肺肿瘤；抑癌蛋白；ＰＴＥＮ；基因表达；分子机制ＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＰＴＥＮｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓＳＨＩＪｉｎｇ，ＧＡＯＦｅｎｇ－ｈｏｕ，ＧＵＯＹｕｅ－ｈｕｉ，ＹＵＡＮＨａｉ－ｈｕａ，ＪＩＡＮＧＢｉｎＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ，ＮＯ．３Ｐｅｏｐｌｅ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌＡｆｆｉｌｉａｔｅｄｔｏＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅｏｆＳｈａｎｇｈａｉＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１９００，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ［ＡＢＳＴＲＡＣＴ］ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｌｏｗｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＴＥＮｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ．ＭＥＴＨＯＤＳ：ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＴＥＮｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓａｎｄｎｏｒｍａｌｈｕｍａｎｌｕｎｇｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌ．Ａｆｔｅｒｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｗｉｔｈｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ（１μｇ／ｍＬ），ＰＴＥＮｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｄｕｒｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｈａｓｅｓ．ＴｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＰＴＥＮｍＲＮＡｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＲＴ－ＰＣＲｉｎＡ５４９ａｎｄＢＥＡＳ－２Ｂ．Ｔｈｅｎ，ｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎＤ（１μｇ／ｍＬ）ｆｏｒｂｌｏｃｋｉｎｇｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ｅｖａｌｕａｔｅｄＰＴＥＮｍＲＮＡａｔｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｉｍｅｐｏｉｎｔｉｎＡ５４９ａｎｄＢＥＡＳ－２Ｂｃｅｌｌｓ．ＲＥＳＵＬＴＳ：ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＰＴＥＮｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｂｙａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ０．３８－１．３２ｔｉｍｅｓｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓeｔｈａｎｎｏｒｍａｌｌｕｎｇｃｅｌｌ．Ａｆｔｅｒｕｓｉｎｇｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ，ＰＴＥＮｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＡ５４９ｈａｄｎｏｔｃｈａｎｇｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｕｒｉｎｇ２４ｈｏｕｒｓａｓｗｅｌｌａｓＢＥＡＳ－２Ｂ．ＲＴ－ＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＰＴＥＮｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｒｏｐｐｅｄｂｙ０．４１－０．６８ｔｉｍｅｓｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＢＥＡＳ－２Ｂ．ＴｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎＤ，ＰＴＥＮｍＲＮＡｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｗａｓｍｕｃｈｆａｓｔｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎＢＥＡＳ－２Ｂ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ：ＴｈｅｓｅｄａｔａｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈａｔＰＴＥＮｍＲＮＡｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎｌｅｄｔｏｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＰＴＥＮ，ｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｓｓｏｍｅｃｌｕｅｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇｔｈｅＰＴＥＮｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｉｎｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ．讨论ＰＴＥＮ基因表达的蛋白既可使丝／苏氨酸去磷酸化也可使酪氨酸去磷酸化，是一个双重磷酸酶。最近，研究发现ＰＴＥＮ蛋白在诸如肺癌、膀胱癌、肾癌、乳腺癌、子宫内膜癌、黑色素瘤及甲状腺癌中常缺失或失活［４］。张建兵等［５］研究发现，ＰＴＥＮ缺失或低表达促进肿瘤的发生、进展并影响患者的治疗疗效及预后。所以，推测ＰＴＥＮ是一个抑癌基因。转染野生型ＰＴＥＮ可致肿瘤细胞生长抑制证实了ＰＴＥＮ抑制肿瘤的作用［６］。但是，到目前为止，并不清楚ＰＴＥＮ在肿瘤细胞中低表达的原因。因此，本研究用肺癌细胞模型探讨ＰＴＥＮ缺失的详细分子机制，发现肺癌细胞中ＰＴＥＮ的ｍＲＮＡ水平稳定性下降是其低表达的一个重要原因。首先，检测不能成瘤的肺支气管上皮细胞及３个肺癌细胞中ＰＴＥＮ的蛋白水平。虽然３个肺癌细胞中ＰＴＥＮ蛋白与内参的比值不尽相同，但它们相较于正常肺支气管上皮细胞中ＰＴＥＮ蛋白与内参的比值显著下调。这与以往文献报道肺癌细胞ＰＴＥＮ蛋白水平低表达是一致的［３］。导致肺癌细胞中ＰＴＥＮ蛋白处于低表达水平可能有诸如蛋白质合成减少的原因，也可能是ＰＴＥＮ蛋白质受某种因素影响稳定性下降而致降解加速的缘故。本研究首先观察肺癌细胞中ＰＴＥＮ蛋白稳定性对其低表达的贡献。应用蛋白质合成抑制剂放线菌酮处理正常的肺支气管上皮细胞及肺癌细胞，当阻断新生蛋白质的合成时，发现２４ｈ内肺癌细胞与正常肺支气管上皮细胞内ＰＴＥＮ与内参的比值都无明显下降的趋势。这说明了在肺癌细胞中ＰＴＥＮ蛋白水平的稳定性并没有显著的改变，导致肺癌细胞中ＰＴＥＮ蛋白低表达有可能发生在蛋白质合成前的某一个阶段。图４肺癌细胞与正常肺上皮细胞ＰＴＥＮｍＲＮＡ稳定性的比较Ａ、Ｂ：１μｇ／ｍＬ放线菌素Ｄ处理ＢＥＡＳ－２Ｂ与Ａ５４９细胞后不同时相ＰＴＥＮｍＲＮＡ水平的改变；Ｃ、Ｄ：图像分析软件分析ＢＥＡＳ－２Ｂ细胞与Ａ５４９细胞中目的基因ＰＴＥＮ的ｍＲＮＡ水平与内参的灰度值，将各自的ＰＴＥＮ／ＧＡＰＤＨ比值作图；※表示与不处理组相比，Ｐ＜０．０５其次，考虑ＰＴＥＮｍＲＮＡ水平在正常肺支气管上皮细胞中与肺癌细胞中是否存在显著的差异。为此，检测了这些细胞中ＰＴＥＮｍＲＮＡ的基础水平，数据显示了肺癌细胞中ＰＴＥＮｍＲＮＡ与内参的比值显著低于正常上皮细胞中ＰＴＥＮｍＲＮＡ与内参的比值。这些结果提示，肺癌细胞中低表达ＰＴＥＮ蛋白的主要发生在ｍＲＮＡ水平上。由于ｍＲＮＡ水平的多少主要取决于该基因转录活化的程度与生成ｍＲＮＡ的稳定性［７］，为明确回答肺癌细胞中ＰＴＥＮｍＲＮＡ低表达这一问题，应用放线菌素Ｄ处理正常肺支气管上皮细胞与肺癌细胞阻断新生ＲＮＡ形成后去观察ＰＴＥＮｍＲＮＡ的代谢规律。结果发现，放线菌素Ｄ处理肺癌细胞２ｈＰＴＥＮｍＲＮＡ水平下调过半，处理１２ｈＰＴＥＮｍＲＮＡ几乎完全降解；而放线菌素Ｄ处理正常肺支气管上皮细胞２ｈＰＴＥＮｍＲＮＡ水平仅轻微下降，处理１２ｈＰＴＥＮｍＲＮＡ水平仍残留过半。这些结果强有力说明肺癌细胞中抑癌蛋白ＰＴＥＮ低表达主要是ＰＴＥＮｍＲＮＡ降解加速所致。Ｙａｎｇ等［８］研究组用转化生长因子（ｔｒａｎｓｌａｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＴＧＦ）作用于癌细胞后，发现胞内ＰＴＥＮｍＲＮＡ含量有所降低，且呈剂量及时间依赖性，与本实验结果基本相符。总之，本研究发现肺癌细胞中抑癌蛋白ＰＴＥＮ低表达主要原因是其ｍＲＮＡ稳定性下降，也就是说肺癌细胞中ＰＴＥＮｍＲＮＡ水平加速降解导致了它的低表达。这些发现为进一步探讨肺癌细胞中ＰＴＥＮ低表达的分子机制提供了线索，也为干预肺癌细胞上调抑癌蛋白ＰＴＥＮ提供了方向。