肿瘤多药耐药的基因治疗

肿瘤多药耐药的基因治疗刘忠民王克勇陈勇肿瘤细胞对化疗药物的耐受性是肿瘤治疗的主要障碍。临床上许多肿瘤在经历了最初有效的化疗之后，最终仍难免于复发，其主要原因是肿瘤细胞对化疗产生耐受性。因此，逆转肿瘤细胞的耐药性，是提高肿瘤化疗疗效的关键。研究表明，肿瘤细胞mdrl基因编码的p-糖蛋白(p-glycoprotein,P-gp)的过度表达是导致肿瘤细胞多药耐药(multidrugresistance,MDR)的重要原因［1］。目前许多药物可以用来逆转肿瘤细胞的MDR，但不能从根本上解决问题，效果欠佳，而且具有一定的毒副作用［2］。与传统的药物治疗相比，基因治疗具有作用特异，敏感，毒副作用低等诸多优点，在MDR逆转中有广阔的发展前景。1MDRl基因的反义寡聚脱氧核糖核酸(AOD)李惠芳等利用互补于MDRl基因5′末端转录起始部位的AOD转染表达MDRl基因的KB-8-5细胞株后，细胞内P-gp表达水平下降，细胞内柔红霉素浓度提高，被转染细胞对药物的LC50由原来药物敏感株的5.6倍降为3.2倍。以上结果说明AOD逆转了P-gp介导的药物耐受性，但逆转作用不完全。作者分析其原因之一为AOD的降解问题。为此，作者以脂质体Lipofectin作为转基因载体，使AOD的耐药逆转作用有所提高，提示脂质体可作为引导AOD靶向治疗的方式之一［3］。针对AOD的降解问题，Cucco等利用硫代磷酸修饰的MDRl基因的AOD进行MDR逆转，发现在体内外均明显提高白血病细胞耐药细胞系对长春新碱(VCR)的敏感性［4］。因修饰后可增加AOD对核酸酶清除作用的耐受性，且易溶于水，能更有效地与靶基因进行杂交，从而增加了其逆转作用［5］。另有作者则认为对核酸上的氧原子进行硫代化、甲基化或用脂质体进行包裹等方法在提高细胞摄入AOD的同时，一方面增加了细胞毒性，同时也降低了核酸反义抑制的效应。将低分子量的聚乙二醇(PEG)连接在AOD的5′的末端，结果显示细胞内AOD摄入率明显增加，高于其它修饰方法，且不影响细胞的生长特性。说明AOD的5′末端连接PEG在反义治疗领域具有广阔应用前景［6］。2MDRl基因的反义RNAAOD的作用是封闭MDRl基因而影响基因的转录，反义RNA则是与MDRl基因的mRNA形成二聚体而抑制mRNA的翻译。曹江等［7］利用高表达反义MDRl-RNA重组质粒pRMAS转染耐药细胞K562/Dox后，其P-糖蛋白近乎阴性，细胞内柔红霉素浓度与敏感细胞系K562几乎一致，说明P-糖蛋白介导的药物外排几乎完全被抑制，显示将反义RNA的模板DNA导入细胞内，可产生大量反义RNA抑制MDRl基因表达。资料还显示细胞除对阿霉素的耐受性完全被逆转外，对长春新碱和柔红霉素的耐受性仍保留9.0倍和14.1倍以上，说明P-糖蛋白表达转阴后，MDR并不能完全逆转，提示还有其它机制作用于细胞的MDR。3切割MDRlmRNA的核酶核酶(Ribozyme)是正常存在于细胞内并调控基因表达的RNA，具有核苷酸内切酶活性，能序列地切割靶RNA，抑制基因的表达。王宝成等设计合成的能切割MDRl-mRNA第196密码子GUC序列的锤头状核酶定向克隆于逆转录病毒载体pDOR-neo的BamHI位点。经病毒包装细胞BA317包装后感染人肝癌MDR细胞株BEL-7402/DOX细胞，RT-PCR证实转化细胞中MDRl-mRNA与未转化细胞相比明显减少甚至不能扩增出来。P-gp的表达，与非转化细胞的93.4%～97.5%相比下降至8.2%～14.6%。并对多种化疗药物重新产生较高的敏感性。以上结果表明表达核酶的逆转录病毒载体转化BEL-7402/DOX细胞后能有效地抑制MDRl基因的表达，使已产生耐药的肿瘤细胞的MDR表型发生逆转［8］。说明应用核酶是逆转肿瘤细胞MDR有效、特异性的方法。4针对MDRl基因调节基因的基因治疗4.1细胞因子基因Stein等［9］的研究发现机体免疫系统的一些细胞因子如TNF，IFN和IL-2可降低MDRl基因mRNA和P-gp的表达水平，增加细胞对MDR相关药物阿霉素(ADM)及VCR的敏感性。但细胞因子静脉应用可产生严重的副作用，将细胞因子基因导入肿瘤细胞，在肿瘤局部微环境中产生和释放细胞因子，可减轻全身应用的副作用。为此，他们又将TNF和IL-2基因转入人结肠癌耐药细胞系HCT15和HCT116细胞中。结果显示TNF和IL-2基因在人HCT15和HCT116细胞中的表达可降低MDRl-mRNA和P-gp的表达水平，使细胞内ADM积累增加，细胞对ADM及VCR敏感性升高。说明TNF和IL-2基因的传染和表达可逆转肿瘤细胞的MDR，联合应用基因治疗和化疗对耐肿瘤的治疗具有潜在的价值［10］。4.2抑癌基因和癌基因研究显示肿瘤组织中p53和P-gp常同时表达［11］，p53基因的突变与人淋巴细胞对烷化剂敏感性下降有关［12］，更有直接证据表明抑癌基因p53的突变可激活MDRl基因的启动子，增加MDRl基因的表达［13］。因此，利用突变型p53基因的反义基因或向细胞内导入野生型p53基因，是MDR基因治疗的一重要方向。另外发现在抗VP-16和顺铂的PC3细胞中bcl-2蛋白比敏感细胞高2～3倍［14］。因此，抑制bcl-2基因的过度表达可为肿瘤耐药的逆转带来希望。Keith等［15］应用bcl-2基因的反义寡核苷酸对17例bcl-2高表达导致对Ara-c耐药的急性髓系白血病病人的骨髓进行体外逆转实验，结果发现7例病人的骨髓细胞bcl-2表达量显著下降，细胞增殖被抑制，并对Ara-c敏感。研究中还发现耐药细胞系的C-myc、C-jun、H-ras的mRNA都过度表达［14］，提示多基因联合治疗对MDR可能更为有效。5结语综上所述，基因治疗可以增加耐药细胞对药物的敏感性，并且具有较强的特异性和无毒性，为肿瘤MDR的逆转开辟了崭新的途径，优化了化学治疗，因而具有广阔的应用前景。但也应注意到目前基因治疗还很不成熟，要真正过渡到临床，尚有大量的工作要做。可以相信，随着对肿瘤分子生物学机制的不断了解，加之基因工程理论与技术的不断发展，不久的将来利用基因治疗不仅能克服肿瘤的耐药性，还能在治疗其他多种困扰人类的疾病中展示出更为巨大的作用。作者单位：刘忠民陈勇泰安市（271000）山东省泰安市中心医院王克勇泰安市（271000）山东省泰安市铁路医院参考文献[1]VolmM,KastelM,MatternJ,etal.Expressionofresistancefactors(P-glycoprotein,GlutathioneS-Transferaseπ,andTopoisomeraseII)andtheirinterrelationshiptoproto-oncogeneproductsinrenalcellcarcinoma.Cancer,1993,71：3981.[2]RadererM,ScheithauerW.Clinicaltrialsofagentsthatreversemultidrugresistance.Cancer,1993,72:3553.[3]李惠芳，孙桂香，卢薇薇，等.多药耐药基因反义寡核苷酸逆转肿瘤细胞耐药的初步研究.中华血液学杂志，1997，18：76.[4]CuccoC,CalabrettaB.Invitroandvivoreversalofmultidrugresistanceinahumanleukemia-resistantcelllinebyMDRlantisenseoligodeoxynucleotides.CancerRes,1996,56:4332.[5]AgrawalS,TemsamaniJ,TangJY.Pharmacokinetics,biodistribution,andstabilityofoligodeoxynucleotideinmice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991,88:7595.[6]胡兵，左大鹏，杨纯正，等.聚乙二醇修饰后MDR-1基因的反义寡核苷酸对K562/AOZ细胞的作用.中华血液学杂志，1997，18：425.[7]曹江，胡汛，潘锵荣，等.MDRl反义RNA表达质粒的构建及其在多药耐药细胞抗药机理研究中的应用.中华医学杂志，1995，75：557.[8]王宝成，郭军，顾广玉，等.切割MDR1RNA的核酶(Ribozyme)肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/DOX化疗耐药性的逆转作用.中国肿瘤生物治疗杂志，1997，4：107.[9]SteinU,WaltherW,ShoemakerRH.ModulationofMDRlexpressionbycytokinesinhumancoloncarcinomacells:anapproachforreversalofmultidrugresistance.BrJCancer,1996,74:1384.[10]SteinU,WaltherW,ShoemakerRH.Reversalofmultidrugresistancebytransductionofcytokinegenesintohumancoloncarcinomacells.JNatlCancerInst,1996,88:1383.[11]LinnSC,HonkoopAH,HoekmanK,etal.p53andP-glycoproteinareoftenco-expressedandareassociatedwithpoorprognosisinbreastcancer.BrJCancer,1996,74:63.[12]FanS,El-DeiryWS,BaeI,etal.p53genemutationsareassociatedwithdecreasedsensitivityofhumanlymphomacelltoDNAdamagingagents.CencerRes,1994,54:5824.[13]ChinKV,UedaK,PastanI,etal.ModulationofactivityofthepromoterofthehumanMDR1genebyRasandp53.Science,1992,255:459.[14]SinhaBK,YamazakiH,EliotHM,etal.Relationshipsbetweenproto-oncogeneexpressionandapoptosisinducedbyanticancerdrugsinhumanprostatetumorcells.BiochimBiophysActa,1995,1270:12.[15]KeithFJ,FradburgDA,ZhuYM,etal.Inhibitionofbcl-2withantisenseoligonucleotidesinducesapoptosisandincreasethesensitivityofAMLblaststoAra-C.Leukemia,1995,8:131.摘自《齐鲁肿瘤杂志》