肿瘤病毒CRISPR

肿瘤病毒——CRISPR/CAS（——一种许多人相信能获得诺贝尔奖的基因编辑新方法）基因组编辑技术依靠使用工程核酸酶，来诱导细胞DNA修复机制，并在不同系统引入可编程的、位点特异性的遗传修饰。这些可编程的核酸内切酶包括锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应核酸酶（TALENs），以及最近开发的CRISPR/Cas9系统。CRISPR/Cas9系统采用短的、单向导RNA（sgRNA），识别靶DNA。与ZFN和TALEN相比，RNA引导的CRISPR/Cas9系统因其灵活、稳健的优势，已被用于不同物种的基因组编辑，包括模式生物、以及农作物和对农业非常重要的动物。基因组编辑工具锌指核酸酶（ZFN）、转录激活样效应物核酸酶（TALEN）和CRISPR/Cas9已被发展用以产生位点特异性的DNA双链断裂（DSBs），可触发内源性非同源末端连接（NHEJ）DNA修复途径，以诱导许多物种（包括斑马鱼）中靶基因的插入缺失突变。转录激活子样效应因子核酸酶（TALEN）是一种可编程的核酸酶，其包含一个FokI核酸酶结构域和DNA结合域。TALEN可诱导基因组中一个精确的、定义的位置的双链断裂（DSB），从而在DSBs被非同源末端连接（NHEJ）修复错误时导致不可预料的基因突变。TALEN可用于结合专门设计的外源供体DNA，来产生大规模的缺失、基因中断、DNA增加或单个核苷酸变化。有众多关于“TALEN介导的基因敲除”的例子报道，但成功的敲入（knockins）是罕见的。西北农林科技大学的研究人员在《PNAS》杂志上发表题为“TALEnickase-mediatedSP110knockinendowscattlewithincreasedresistancetotuberculosis”的学术论文。研究人员把小鼠基因SP110通过一种称为转录激活样效应因子核酸酶调控的基因组修饰方法，插入到牛的基因组中，得到了一种转基因牛，它表现出了对牛结核菌感染的抗性，牛结核菌是造成动物与人结核病的一种细菌。苏州大学王晗课题组在国际著名学术期刊《JournalofBiologicalChemistry》发表了题为“ThezebrafishPeriod2proteinpositivelyregulatesthecircadianclockthroughmediationofRAR-relatedorphanreceptoralpha(Rorα)”。他们用利用TALEN技术，成功制备了两种斑马鱼per2无效突变体，阐明了Per2在斑马鱼生物钟中的基本功能，并为PER2在脊椎动物昼夜节律系统中的积极作用，提供了关键的证据。武汉大学郭德银教授：用CRISPR/Cas9攻克艾滋病《ScientificReports》杂志发表了题为“GenomeeditingofCXCR4byCRISPR/cas9conferscellsresistanttoHIV-1infection”的论文，他们在新研究中证实，借助于CRISPR/cas9对CXCR4进行基因组编辑可赋予细胞对HIV-1感染的抵抗力。中国学者Nature子刊：一种高效安全的新型RNAi载体2015年10月12日刊NatureCommunications在线发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所国家蛋白质科学中心（上海）吴立刚研究组的最新研究成果“Ribozyme-enhancedsingle-strandedAgo2-processedinterferingRNAtriggersefficientgenesilencingwithfeweroff-targeteffects”，该成果发明了一种较传统shRNA（shorthairpinRNA）更为安全的高效RNA干扰（RNAi）载体——saiRNA。RNAi是由siRNA介导的特异性降解具有互补序列的RNA，从而在转录后水平沉默靶基因表达的现象。RNAi在真核生物进化中高度保守，目前已被广泛应用于基因功能的研究，并可开发成为小核酸药物直接用于疾病治疗，近期已有几十种siRNA药物进入一期或二期临床试验，有望成为续小分子化合物和蛋白质（抗体）药物后的另一类新型的药物，具有很大的应用潜力。RNAi发挥基因沉默功能的核心成分是RISC复合物，主要由外源提供的siRNA与细胞内的Ago家族蛋白质组装形成。在哺乳动物中，外源siRNA主要通过两种方式获得：一种是通过化学方法直接合成双链siRNA分子，通过转染进入细胞质内与Ago蛋白结合并沉默靶基因。但化学合成siRNA的成本较高，在细胞或动物体内容易被代谢（如核酸酶）清除，作用持续时间较短，且一些类型的原代细胞难以被高效转染，因此在应用上具有一定的局限性。另一种获得siRNA的方式是通过DNA载体，利用细胞内源的RNA聚合酶Ⅲ（RNAPolⅢ），如U6、H1等的启动子驱动转录表达shRNA，转录产生的发夹状shRNA可以被细胞内源的Dicer蛋白识别并加工成siRNA，然后与Ago蛋白结合发挥作用。shRNA的表达框不仅可以构建在质粒载体上直接转染细胞进行瞬间基因沉默，还可以构建成慢病毒（lentivirus）载体，能感染大多数种类的宿主细胞并长期沉默靶基因，在高通量的功能基因筛选中有广泛的应用；如果将shRNA构建在腺病毒（ADV）和腺相关病毒（AAV）载体上，可以实现在动物整体或特定组织中沉默靶基因。任何一种技术都有其优点和缺陷，RNAi技术也不例外。随着其广泛应用，RNAi的毒副作用逐渐被认识和报道，其来源主要包括两大类：（1）脱靶作用（off-target）。由于siRNA不仅可以通过完全互补配对的方式切割靶标RNA，还可以通过与RNA部分互补配对，以类似miRNA（microRNA）的作用方式（即2-7位seedregion的碱基配对）非特异性抑制靶基因以外其它基因的表达。（2）对细胞内源miRNA的竞争抑制。由于shRNA的加工需要细胞内的Dicer、Exportin-5、Ago等蛋白质因子协助，而这些蛋白质因子也是细胞内源miRNA加工成熟所必须的。由于miRNA是细胞功能的重要调控分子，过表达的shRNA与内源miRNA竞争相同的加工机器，必然对内源miRNA的表达和功能造成抑制作用。研究标明，目前常用的传统shRNA对细胞内源miRNA具有较强的非特异性竞争抑制作用，在小鼠肝脏中长期高表达shRNA会造成严重的肝脏损伤并引发肝癌导致动物死亡。因此，如何设计一种更好的RNAi载体，在高效沉默靶基因的同时降低其毒副作用，是RNAi技术应用中亟待解决的关键科学问题。目前被广泛使用的传统shRNA具有21bp或更长的双链区，这种设计是基于以往的研究结果：shRNA的双链区如果小于21bp就不能被细胞内的Dicer有效加工和生成siRNA。科研人员在研究中设计siRNA前体时，将双链区长度小于21bp的siRNA的靶向区延伸入顶端环区域，结果双链区为16-18bp的siRNA前体的加工就不再依赖于Dicer，而由RNAi的核心蛋白Ago2直接在双链区3’臂（3’arm）的第10个碱基位置进行切割，产物被细胞内的外切核酸酶进一步在3’端切短，并最终形成长度为24-27nt的单链siRNA。他们称具有这种结构特征的siRNA前体为saiRNA（single-strandedAgo2-processedinterferingRNA）。saiRNA依赖于Ago2的加工途径与细胞内一种特殊的miRNA（miR-451）的加工途径非常类似，而介于shRNA和saiRNA两种长度之间的siRNA前体既不能被Dicer，也不能被Ago2所加工，因此几乎完全没有沉默活性。进一步研究发现，saiRNA茎环结构的3’端悬垂（overhang）长度对Ago2的结合效率起决定性作用。而通常由RNA聚合酶III（polIII）转录生成的saiRNA末端有较长的3’端悬垂，无法直接被Ago2所高效识别和结合，影响了saiRNA的加工和沉默功能。因此，研究人员在saiRNA的3’末端融合了一种特殊的核酶（HDVribozyme，丁型肝炎病毒核酶），利用该核酶的高效自切割活性，准确地在saiRNA的3’端产生两个碱基悬垂，大大提高了saiRNA前体与Ago2蛋白的结合效率，从而显著增强saiRNA对靶基因的沉默效率。核酶增强的saiRNA相较于传统的shRNA具有以下优点：（1）脱靶作用（off-target）小。哺乳动物中Ago蛋白家族包含四个成员，但其中只有Ago2具有RNAi活性（切割完全互补配对RNA的核酸内切酶活性），而Ago1、3、4没有RNAi活性却会引起较强的脱靶作用。与传统shRNA产生的siRNA能与所有Ago蛋白结合不同，saiRNA只有与Ago2结合后才能被加工产生成熟的siRNA，因此有效避免了由Ago1、3、4介导的脱靶作用。并且其特殊的加工方式只产生一条导向链（guidestrand，具有基因沉默功能的siRNA链），不会产生passengerstrand（与guidestrand互补配对的没有基因沉默功能的siRNA链），因此也就完全避免了由passengerstrand与Ago蛋白结合后产生的脱靶作用。（2）对细胞内源miRNA的影响小。不论是化学合成的saiRNA，还是基于RNA聚合酶III的DNA表达载体在细胞内转录生成的saiRNA，其被加工后产生的siRNA的单位浓度分子对靶基因的抑制效率都高于传统的shRNA。因此，在同样的沉默效率下，saiRNA产生的成熟siRNA在细胞内的积累量要远低于shRNA，避免了占用大量Ago蛋白，并且其加工不需要Dicer等miRNA加工所必须的蛋白质因子，大大减少了对细胞内源miRNA加工和功能的竞争作用。总之，saiRNA作为一种新型的RNAi载体，具有高效和低脱靶的特点，通过对saiRNA设计的继续优化，以及动物整体的基因沉默实验，为科学研究和基因治疗应用提供更好的工具。NIBS邵峰博士Nature揭示炎症坏死新机制2015年9月16日的《Nature》发表了北京生命科学研究所（NIBS）邵峰（FengShao）博士课题组的论文“CleavageofGSDMDbyinflammatorycaspasesdeterminespyroptoticcelldeath”，他们借助于CRISPR-Cas9基因组编辑技术进行全基因组筛查，鉴别小鼠骨髓巨噬细胞中参与caspase-11和caspase-1介导的炎症坏死的宿主因子由此发现了GSDMD。CRISPR提供新型乙肝治疗策略2015年9月3日Nature子刊《ScientificReports》发表了德国HeinrichPette研究所、UniversityMedicalCenterEppendorf和GermanCenterforInfectionResearch(DZIF)等处的研究人员的论文“CRISPR/Cas9nickase-mediateddisruptionofhepatitisBvirusopenreadingframeSandX”，可以使用CRISPR/Cas9切口酶，作为HBV感染的新型治疗策略。在HBV基因组的S和X区中确定了交叉基因型保守的HBV序列，可被Cas9切口酶靶定进行特异性和有效的切割。这种方法不仅能破坏记者细胞系中的游离cccDNA和染色体整合HBV靶位点，而且也能破坏慢性感染和新感染肝癌细胞株中的HBV复制。这些数据表明，可以使用CRISPR/Cas9切口酶，作为HBV感染的新型治疗策略。最近，Cas9酶的一种突变“切口酶”版本（Cas9n）已经得以描述，它能够基于一段共表达的引导RNA（gRNA）界定的靶序列（而不是野生型酶产生的双链DNA断裂，DSBs），在特异位点引入单链DNA断裂（nick）。因此，通过Cas9切口酶（Cas9n）和一对适当间距的gRNAs、两个相邻、相反的链缺口，可引起DSBs，并触发易出错的非同源末端连接（NHEJ）修复。重