胃蛋白酶提取的分离纯化

胃蛋白酶提取法中分离纯化技术的研究进展摘要：本文就胃蛋白酶的生物提取法，对其在生产过程中的分离、纯化技术展开综述。其中，分离技术主要介绍了：盐析法、有机溶剂沉淀法、底物亲和法、透析法。纯化技术主要介绍了：凝胶过滤法、透析离子交换法。综合比较各分离纯化方法的特点，得到最优的分离纯化方法有机溶剂与盐析共沉淀法、膜分离技术、等电点沉淀法与底物亲和法。关键词：胃蛋白酶分离纯化应用．生物提取法生产胃蛋白酶1．1工艺路线（自溶、过滤）（脱脂、去杂质）猪胃黏膜→自溶液→上清液（浓缩、干燥）→胃蛋白酶成品1.2工艺过程（1）原材料的选择和预处理：胃蛋白酶原主要存在于胃粘膜基底部，采集原料时剥取的粘膜直径大小与收率有关。一般取直径10cm、深2-3mm的胃基底部粘膜最适宜，每头猪胃平均剥取粘膜100g左右。（2）自溶、过滤：在夹套锅内预先加水100升及盐酸3.6-4升，加热至50度时，在搅拌下加入200千克猪胃黏膜，快速搅拌使酸度均匀，保持45—48度，消化3-4小时，得自溶液。用纱布过滤除去未消化的组织尿蛋白，收集滤液。（3）脱脂、去杂质：将滤液降温至30℃以下，加入15-20％氯仿或乙醚，搅匀后转入沉淀脱脂器内，静置24-48小时，使杂质沉淀，分出弃去，得脱脂酶液。（4）浓缩、干燥：取清酶液，在40℃以下减压浓缩至原体积的1／4左右，再将浓缩液真空干燥。球磨过80-100目筛，即得胃蛋白酶粉。2胃蛋白酶的分离技术2.1有机溶剂法可用于胃蛋白酶的初步提取浓缩。通常使用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、异丙酮，其沉淀蛋白质的能力为：丙酮＞异丙酮＞乙醇＞甲醇。当然此顺序也不是一成不变的，因为还要受温度、pH、离子强度等因素的影响。丙酮沉淀能力最好，但挥发损失多，价格较昂贵，所以工业上常采用乙醇作为沉淀剂。2．2盐析法盐析法是酶制剂工业中常用方法之一，硫酸镁、硫酸铵、硫酸钠是常用的盐析剂，其中用的最多的是硫酸铵。美国专利（2，701,228）改进后，用锌盐沉淀胃酶。当母液含醇（或酮）在50%--55%、pH在5.0—5.2时几乎全部胃酶可以用醋酸锌沉淀，沉淀物为胃酶的锌盐，然后用金属螯合剂除去锌盐，得15000—16000倍活力的酶，收集率为5.0%--5.5%。此法较上述有机溶剂沉淀所得的胃酶活力和得率都高。2.3底物亲和法底物亲和法是利用酶（胃蛋白酶）与其底物（酪蛋白）的亲和性，从胃粘膜中提取得到胃蛋白酶。使底物和酶在pH2.5的乳酸缓冲液中充分结合，然后调pH至4（底物的等电点）沉淀底物和酶的结合物，随后让沉淀物再溶解于乳酸缓冲液中，添加低浓度的SDS将底物和酶分离，得到酶—SDS复合物，再进一步分离纯化。陈躬瑞（2001）成功的应用此法对蛇胃蛋白酶进行了实验室分离，得率大约为30%。与传统的分离方法比较，此法具有简单高效的优点，为后续的纯化工艺避免了昂贵的活化试剂和配基的使用，同时具有较高的特异性。【2】2.4透析法胃蛋白酶的分离过程中还经常用到透析法。该法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性而与小分子物质及盐分开的。由于透析主要是扩散过程，如果袋内外的盐浓度相等，扩散就会停止，因此要经常换溶剂，一般一天换2—3次。如在冷处透析，则溶剂也要预先冷却，避免样品变性。透析时的盐是否除净，可用化学试剂或电导仪来检测。【1】3胃蛋白酶的纯化技术3.1凝胶过滤法美国在20世纪60年代研究结晶为蛋白酶的生产工艺时，是将75mg的胃蛋白酶原样本溶解在8mL的蒸馏水中(pH5．0～6．0)，在14℃±1。，pH2．0下，保持20min激活。然后用磺乙基SpandexG-25层析，最后用羟基磷灰石进行色谱层析。结果表明用层析法得到的胃蛋白酶为单一物质纯品。3.2离子交换层析法陈躬瑞等人在纯化蕲蛇胃蛋白酶时将SDS沉淀后的上清液上样到预先用0．05mol／L乙酸缓冲液(pH5．0)平衡的DEAE—TOYOPEARL离子交换色谱柱(4．6mmX100mm)上，用0～O．25mo1／L氯化钠梯度洗脱，流速为1ml／min。得到的酶在5O℃30min有较高的活性，有望应用于高温食品加工中。【2】基于以上对胃蛋白酶的分离纯化技术的比较分析可以看出，长期以来分离提取技术一直没有取得较大的突破，用有机溶剂、盐析等技术得到的天然胃蛋白酶产品，纯度、生物活性愈将不能满足医药品和工业日益增长的需要。随着分离科学技术的不断发展，采用新型分离技术分离胃蛋白酶已势在必行。因此，大多数学者认为以下几种技术是胃蛋白酶分离纯化的方向。3.2．1有机溶剂与盐析共沉淀有机溶剂和盐析法都是分离纯化胃蛋白酶的传统方法，有其各自的特点。如果将有机溶剂和盐析配合使用，不仅可以降低盐的用量，而且可以不同程度的消除各自分离纯化所带来的问题，得到的胃蛋白酶纯度和活性也会有所增加。3.2.2膜分离技术分离膜是一种特殊的、具有选择性透过功能的薄层物质，能利用分子大小实现分离，从而起到浓缩和分离纯化的作用。由于其可在维持原生物体系环境的条件下实现分离，并可高效地浓缩、富集产物，有效地去除杂质，加之操作简单，结构紧凑、能耗低，过程简化，无一次污染，也将成为胃蛋白酶分离纯化工艺的研究方向。3.2.3等电点沉淀法与底物亲和法胃蛋白酶具有极低的等电点(如猪胃蛋白pH1．0)，但胃蛋白酶的分离纯化技术中等电点沉淀法未见报道，如果此方法可实现，那将大大缩短分离纯化的时间。底物亲和法是分离纯化胃蛋白酶的新亮点，但其工艺条件还不成熟，尤其是在分离底物和酶的复合物时，SDS的添加量有待研究。4结论有人预言，21世纪将是生物技术的世纪，尤其是生物制药技术的世纪。生物制药被誉为21世纪的“朝阳产业”。得益于生物制药技术的酶类药物也日趋成熟。高效的胃蛋白酶分离纯化工艺、技术和设备的出现，人们必将开发出高效的胃蛋白酶提取工艺。这对于提高功能性胃蛋白酶产品、提高生产率、降低生产成本和改善人民生活水平起着举足轻重的作用。而胃蛋白酶单一组分的制备分离，可为胃蛋白酶的研究开发提供标准品，同时能为后期胃蛋白酶单一组分生理活性的研究提供必要的物质保障。参考文献[1]张继平，郭照良，唐东生等.暗纹东方纯胃蛋白酶的分离纯化及部分性质研究[J]，湖南农业大学学报，2004（30）：526-529[2]陈躬瑞、柯李晶、赵恒裕等．底物亲和法分离纯化薪蛇胃蛋白酶[J]，中国食品学报，2001(1)：5O-55[3]黄纯，生物化学，科学出版社，北京，2004.9，18-49