胆囊炎发病机制与模型的建立

发布日期20040929栏目化药药物评价非临床安全性和有效性评价标题胆囊炎发病机制与模型的建立作者高建平部门正文内容1胆囊炎发病机制与模型的建立审评一部高建平胆囊炎是最常见的胆系疾病之一，其和胆囊结石二者互有联系，胆囊炎的主要类型为结石性胆囊炎，而胆囊结石通常又有炎症的表现。胆囊炎按其发病的缓急分为急性胆囊炎和慢性胆囊炎。急性胆囊炎是外科领域中常见的急腹症，其发病率仅次于急性阑尾炎，占炎性急腹症的第二位。急性胆囊炎有结石性胆囊炎和非结石性胆囊炎两大类。约95%的急性胆囊炎是因胆囊结石阻塞胆囊管并继发感染而引起的。非结石性胆囊炎尽管临床比例较低，但由于这类胆囊炎发病隐匿、临床症状不典型、病情重且进展快，易于发生胆囊坏死与穿孔，必须引起高度重视。慢性胆囊炎是指胆囊因长期或间断地受到刺激而产生的明显的慢性炎症改变及或功能障碍，其中急性胆囊炎症消退后遗留下来的病理状态，是慢性胆囊炎的常见类型。由于病因及病理变化的不同，一般将本病也可分成慢性结石性胆囊炎和慢性非结石性胆囊炎，而85%-95%为结石性胆囊炎[1-2]。一.病因1．结石性胆囊炎结石性胆囊炎的病因多以胆囊排空受阻开始，结石机械损伤，胆汁淤积引发胆囊内高压，代谢障碍、细菌感染及神经因素等，其中结石造成胆囊管梗阻是最常见的病因[1-2]。①胆囊管梗阻结石嵌顿，胆囊管过长、扭曲，胆囊管螺旋瓣的异常，炎性水肿或纤维化，肿瘤内堵外压，胆道寄生虫病等多种情况可引起胆囊管或胆囊颈的阻塞。②细菌感染急性胆囊炎时胆囊胆汁的细菌培养阳性率高达80%-90%，包括需氧菌与厌氧菌感染，其中肠源性革兰氏阴性杆菌为最常见的致病菌。细菌的来源主要通过十二指肠上升性途径、经淋巴或血运、经肠肝循环途径以及由邻近脏器细菌感染所波及。细菌在酶的作用下使结合胆汁酸转变成有毒的游离胆汁酸，也可加重组织损伤和炎症。③化学刺激胆汁成分之一的胆汁酸（尤其是细菌作用后的游离胆汁酸）、逆流的胰液和溶血卵磷脂，对细胞膜有毒性作用和损伤作用，对胆囊黏膜的局部刺激可造成炎症。其中由肝脏与胰液中的磷脂酶作用于胆汁成分卵磷脂而生成的溶血卵磷脂，对细胞膜的损伤尤为严重。研究证实结石性胆囊炎的炎症发生主要是结石刺激胆囊上皮细胞释放溶酶体磷脂酶，该酶是炎症发生和发展过程中的中介物质，而且能促使卵磷脂转化为溶血卵磷脂，直接损伤细胞膜，胆囊在各种炎症因子的综合作用下，发生充血、水肿、炎性细胞渗出和出血，甚至细胞坏死等病理变化，使结石性胆囊炎得以形成。另外高浓度胆盐，饱和胆汁，以及胆汁中的胆固醇结晶和前列腺素等也对细胞膜产生损害作用。④神经因素手术创伤或长期禁食等造成的内脏神经功能紊乱，可导致胆汁郁积、胆囊局部血供障碍等变化，从而导致胆囊炎症。2．非结石性胆囊炎非结石性胆囊炎的病因可能与下列因素有关：胆囊壁局部血供障碍；胆汁淤滞及其成分变化；感染及免疫功能低下、使用抗生素过敏等[1-2]。二.病理生理的改变急性胆囊炎的早期多以化学性炎症为主，随着胆囊内胆汁的滞留瘀积，胆囊内压增加，胆囊壁血供受累，胆囊壁组织的抵抗力不断降低而继发细菌感染。慢性胆囊炎病理变化包括壁层小血管硬变与栓塞、单核细胞浸润和纤维组织增生，黏膜上皮糜烂溃疡或萎缩，肌层下肉芽组织、腺体腺管的淤积增生[1]。对急性非结石性胆囊炎的病理生理特点研究发现，发烧、高血压、坏疽样胆囊、G-菌性败血症、多器官衰竭、黄疸以及碱性磷酸酶的不成比例升高是其常见表现，而内脏动脉灌注不足和败血症是急性非结石性胆囊炎的主要病理生理过程，胆囊炎症、胆汁淤积及继发的细菌侵入导致多发性坏疽是非结石性胆囊炎的终末阶段[3]。而对急性结石性胆囊炎研究表明，患者血液中的一氧化氮（NO）和过氧化脂质含量显著升高，维生素C(P-Vc)含量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽酶(E-GSH-Px)活性显著降低[4-6]。血清中IL-6水平的高低可以反应全身性炎症程度[6]，在急性胆囊炎患者血清及胆汁中的IL-6的浓度显著高于胆囊癌、慢性胆囊炎和正常胆囊。另外，急性胆囊炎、胆囊结石的血清、胆汁中淀粉酶及同工酶水平均升高[7]。胆囊收缩素(CCK)是胆囊收缩的主要调节肽。研究表明，健康的胆囊CCK诱导的收缩是由CCK-A受体介导而可被前列腺素减弱。而胆囊中胆石的存在与前列腺素介导的CCK收缩胆囊作用的消失有关。然而在胆囊炎后期，5-羟色胺的过量释放使胆囊响应CCK的收缩作用正常化。提示胆囊炎的不同阶段会影响一系列对CCK改变胆囊运动有重要影响的炎症介质[8]。胆汁中的高胆固醇通过下调胆囊CCK-R表达而导致胆囊收缩功能障碍，降低胆汁高胆固醇水平可以促进胆囊动力功能的恢复[9]。三．模型的建立对于胆囊炎发病原因和病理的研究，可以指导胆囊炎模型的建立。而在实验过程中对模型的选择，可根据药物的功能主治的侧重点，选择适宜的动物模型。根据胆囊炎的发病原因及机制，胆囊炎和胆结石的模型常见的主要有以下几种：（一）化脓性胆道感染模型1、内毒素造模法：细菌感染是胆囊炎发病的主要原因之一。急性胆囊炎时胆囊胆汁的细菌培养阳性率高达80%-90%，胆道感染以G-菌为主，特别是大肠杆菌较多。故常采用大肠杆菌诱发动物的胆道感染。研究证实内毒素（大肠杆菌脂多糖）引发负鼠（opposum）胆囊局部缺血性损伤模型类似于非结石性胆囊炎。对负鼠静脉注射0.005mg/kg的内毒素导致黏膜表面的破损和大面积的出血；高剂量的内毒素导致黏膜凝固坏死，出血，大面积纤维蛋白沉积，广泛的黏膜的缺失，与急性缺血性损害一致。内毒素可消除胆囊平滑肌条对CCK及电刺激反应而造成胆囊淤积[10]。2、细菌感染加胆石胆囊内注射[11]结石机械损伤，造成胆囊管梗阻是胆囊炎的另一主要病因。以一定量的临床常见胆道感染细菌加胆石混悬液注射于动物的胆囊或胆管内使之形成化脓性感染模型。此方法结合了临床的胆囊炎的最主要的致病因素，更贴近于临床。造模成功的动物，胆汁流量减少，Oddi氏括约肌张力增加，组织学检查肝与胆囊、胆管有炎症反应。药效可根据用药后胆流量，Oddi氏括约肌张力及组织学检查来确定模型的成功和药物的疗效。（二）总胆管结扎模型：总胆管结扎（CBDL）可制作有急性胆囊炎症的非结石性胆囊炎的模型，通过降低平滑肌的收缩性和降低神经介导的收缩。而神经介导的收缩性的改变是由于胆碱能神经的功能障碍和一氧化氮介导的对平滑肌收缩性的抑制作用的提高[12-13]。总胆管结扎合并胆道细菌感染是常用的方法之一[11]。结扎动物胆总管发生部分性狭窄和胆汁淤积。在胆管结扎上部注射细菌，一周内即可形成化脓性炎症反应。通常采用家兔，麻醉后开腹部，经十二指肠乳头插入塑料导管至肝门以上肝胆管。在胆总管中段内衬导管下结扎肝总管，造成部分性狭窄。从导管注入兔大肠内容物的混悬液2ml，然后用线将针孔结扎，关闭腹腔，术后分笼常规饲养。术后兔不爱吃食，胆道梗阻严重的可出现黄疸，剖检时组织学检查肝、胆，可发现有炎症、坏死等。药效可根据兔肝胆系统的病变程度评价。（三）化学物质诱发胆囊炎模型：1、石胆酸诱发胆囊炎的模型：口服石胆酸（lithocholicacid,LCA）可对肝脏产生毒性，使肝细胞变性和坏死、肝细胞功能下降、胆汁代谢障碍、内源性β-葡萄糖醛酸酶（β-GCD）活性明显增高、Ca2+等增多，在诸多因素共同作用下，最终诱发动物胆囊炎或结石形成。给豚鼠按300mg/kg体重灌服石胆酸，每日一次，连续15天，即可造模成功。模型成功的动物，剖检时胆囊内可发现有悬浮物或若干泥沙样结石，药效可根据成石动物数、肝与胆汁β-GCD活性、酸性粘多糖及胆汁成分的变化、肝胆组织学检查等来评价。2、黄疸型胆囊炎模型：林可霉素可引起黄疸和转氨酶的升高，采用皮下注射盐酸林可霉素可制造黄疸型胆囊炎模型[14]，采用该方法可引起豚鼠胆囊的黏膜水肿、渗血、乳头增生、固有膜腺体向下浸润、炎细胞浸润等反应。（四）、结石模型结石嵌顿造成胆囊管梗阻是诱发胆囊炎的最常见的病因。因此，根据胆囊炎的发病原因，如果是由于胆囊结石所造成的胆囊炎，则动物试验可以采用结石模型来研究药物对结石型胆囊炎的治疗作用。结石型胆囊炎主要有以下几种：1、胆固醇结石模型正常胆汁中含有一定浓度的胆汁酸盐和磷脂，与胆固醇、蛋白质等组成胶性微粒悬浮于胆汁中而不析出，长期以高胆固醇剥夺维生素C的饮食使体内胆固醇升高，胆汁酸和磷脂含量相对或绝对降低，各成分比例失调，致使胆汁中胆固醇过饱和、钙离子增多而形成胆固醇结石。用含1%双氢胆固醇的饲料喂养家兔，2～6周可诱发结石造模成功的动物，可在胆囊内找到直径约1mm的多发性结石，有较多胆固醇结晶块，部分呈放射状结晶排列。2、胆色素结石模型胆色素结石好发于高碳水化合物膳食的人群，患者胆汁成分与正常人相比，其磷脂含量明显增高。给豚鼠饲以低蛋白饲料造成肝脏及胆汁中β-葡萄糖醛酸酶活力增高，促使结合胆红素水解成游离胆红素，与钙离子结合形成不溶于水的胆红素钙盐，在其它因素的影响下进一步形成胆色素结石。豚鼠每日喂以致石饲料50g（其中2%酪蛋白、3%蔗糖、2%猪油、2%纤维素、0.04%胆酸、0.1%胆固醇）喂养1.5-3个月。造模成功的动物，尸检时，肉眼可见胆囊或外胆管内有结石颗粒或包含浑浊絮状物。3、胆色素混合结石模型之一将人不同类型的结石或蛔虫碎片以及其它异物直接植入动物胆囊内，以此为核心会诱发大量的结晶析出。脱落的胆道上皮细胞、细菌尸体、蛔虫碎片等均可为结石形成提供核心，使之增大。此方法可采用兔或狗，造模成功的动物，尸检时胆囊内，在异物表面沉积大量黏液和胆色素等成分，也可见由数个异物黏合成团的较大结石或黑色胆砂。药效可根据成石动物数、结石重量变化、胆汁成分、肝胆组织学检查等作为检测指标。4、胆色素混合结石模型之二以一定量的细菌注入胆总管引起感染时，大肠杆菌产生β-葡萄糖醛酸酶，可使水溶性胆红素水解为游离胆红素，后者再与钙结合形成不溶性胆红素钙，在粘液物质的凝聚下形成胆色素结石而析出，加上胆总管被结扎，胆道梗阻，更导致细菌繁殖加快和促使感染加重，可诱发胆色素混合结石。操作方法为在近肝门处结扎麻醉大鼠的胆总管，然后向胆总管内注入1.5×106菌数/ml的大肠杆菌菌液0.1ml/10g，一般经3～8周可诱发胆色素混合结石。造模成功的动物，尸检时可见其发生梗阻性黄疸，肝内外胆管有不同程度淤塞与扩张，在胆囊及胆管内可见黄褐色或深褐色的混合结石。四、关于试验指标的选择对于不同的胆囊炎模型，根据其病理生理的改变，可以选择相应的指标作为评价药效学的依据。⑴胆囊的炎性改变是多数胆囊炎的共同表现。胆囊、肝或肝外胆管有无炎症病变及病变程度，是反映治疗胆道感染、胆石病中药新药疗效的最直观的指标，因此对胆囊进行病理组织学的检查是最常采用和非常重要的指标。（2）化脓性胆道感染的动物数或感染程度是反映治疗胆道感染中药疗效的常用的观察指标，同时还可以进行感染动物外周血红细胞计数、白细胞总数及其分类的测定，对胆汁中菌落的测定。（3）胆囊中有无结石即成石动物数、结石的定性可以反应对于结石性胆囊炎是否有疗效的中药的主要观察指标。⑷其他可供分析的指标：①血液生化学指标检查：总胆固醇、甘油三酯、天门冬氨酸转换酶、丙氨酸氨基转换酶；②胆汁流量；③胆汁成分的分析：、胆汁酸、总胆红素、游离胆红素、胆固醇、钙离子含量；④肝脏或胆汁中β-葡萄糖醛酸酶（β-GCD）活力，内源性的β-GCD过增能在结石形成中起主导作用，胆囊产生炎症时该酶的活性增高；⑤胆道动力学变化：如Oddi括约肌的张力或胆囊功能。在过饱和胆汁作用下，胆囊管阻力增高和胆囊排空障碍会促进结石形成；⑥血液的胃动素或胆囊收缩素的水平。五.小结与讨论动物模型作为人类疾病的替身在药物疗效评价上担当着非常重要的角色。而动物模型的选择首先考虑的就是相似性的原则，即复制的动物模型要与人类的疾病相似，模型在制作方法上应尽量靠近疾病发病的根本原因。而模型的诊断标准也要尽量向临床人的诊断标准靠近，检测指标的选择上应根据疾病的病理生理的改变尽量选择与本病相关性高、特异性强并且比较稳定可行的指标来评价模型的成功与否以及药物的作用效果。