胡萝卜愈伤组织的培养

胡萝卜愈伤组织的培养摘要：实验中的胡萝卜的组织培养实验成功率比较低，主要体现在污染率较高和出芽率低上，在长期的实验中，有些胡萝卜的愈伤组织基本分化不出芽。针对这一问题我们反复实验。通过把培养出来的胡萝卜的愈伤组织进行悬浮培养后，再转接到固体培养基上，从而使得胡萝卜愈伤组织更容易分化出芽来。并使整个过程控制在无菌条件下，现就胡萝卜组织培养的整个实验过程控制作一详细介绍。关键词：胡萝卜；组织培养；无菌控制1.实验流程（1）实验总流程：MS母液培养基的配置→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的配制→胡萝卜愈伤组织诱导→胡萝卜愈伤组织的继代培养→观察记录（2）无菌操作流程：实验员消毒→实验室、无菌台灭菌→实验器材的灭菌→无菌接种→消毒→实验台卫生（3）胡萝卜愈伤组织诱导培养流程：胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配置→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基的分装→胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基灭菌→取材及材料的消毒灭菌→接种与培养（4）胡萝卜愈伤组织的继代培养流程：器械及实验者的消毒灭菌→剥离愈伤组织诱导培养所得的愈伤组织→胡萝卜愈伤组织接种2.实验仪器及材料胡萝卜(市场购买)、超净工作台、光照培养架、高压蒸汽灭菌锅、恒温振荡器、打孔器、小刀、培养皿、解剖刀、镊子、植物组培试剂盒。3.实验方法与步骤3.1胡萝卜愈伤组织的诱导①外植体消毒用清水洗干净胡萝卜直根，用小刀给其削去表皮，并切成小段放入烧杯中。先用70%酒精对胡萝卜直根消毒5min，用无菌吸水纸吸干，再用10%的次氯酸钠溶液消毒10min（或用0.1%的升汞消毒10min,接着用无菌水漂洗一遍，再用无菌水浸泡30min），放入无菌水中漂洗2~3次，用无菌吸水纸吸干待用。②外植体接种。把消毒好的胡萝卜直根放入无菌培养皿中，用消毒好的小刀沿截面将其横切成厚度1mm左右的小圆片，然后将小圆片的韧皮部和木质部切去，留下形成层，再将形成层切成大约长5mm、宽5mm、高1mm的小长块(如图1a)。为了操作简便、快速，外植体美观，建议使用打孔器切取胡萝卜外植体。具体操作方法:把消毒好的胡萝卜直根放于无菌培养皿中(建议使用一次性塑料培养皿)，用小刀将其切成2~3cm的小段，用灭过菌的打孔器沿着形成层穿入胡萝卜中，取得一段含有形成层的2~3cm的圆柱体，然后用无菌解剖刀片将其切成厚1mm的小薄片，将切好的胡萝卜外植体接种在MS+2mg/L2,4-D+1.5mg/LKT的固体培养基上，放于黑暗处25℃条件下进行暗培养，50d后长出淡黄色愈伤。3.2胡萝卜愈伤组织悬浮体系的建立用镊子夹取在固体培养基上继代20d的胚性愈伤组织即分散性好、疏松的愈伤用解剖刀切碎，接种在MS+0.3mg/L2，4-D+3%蔗糖的液体培养基(pH5.8)中，每100mL的三角瓶中加入MS液体培养基50mL，摇床转速为110r/min，温度为25℃，黑暗培养，每隔7d继代一次，连续培养4代~5代后逐渐形成稳定的细胞系。3.3悬浮细胞系的继代采用吸取法、静止法和瓶壁法进行继代培养。吸取法是用吸管吸取一定体积的悬浮培养物转入至新鲜培养基的一种方法。静止法是将培养物摇匀，静止片刻，待大块的愈伤组织和细胞团下沉后，将上清部分转至空的灭菌三角瓶，再静止直至细胞团基本沉入瓶底，小心弃去1/2体积的上清，然后添加新鲜培养基进行继代培养的一种方法。瓶壁法是利用悬浮培养物在振荡培养的过程中会产生附壁现象，即在三角瓶的周围形成一个细胞圈，然后将这一部分细胞用勺子刮下转入新鲜培养基中进行继代培养的一种方法。3.4胡萝卜愈伤分化将胡萝卜悬浮细胞和愈伤组织分别转入含不同激素及其组合的分化培养基中，25℃，光照培养。分化培养基分别为:①B5(MS)基本培养基(不添加激素)；②B5(MS)基本培养基+1.0mg/LBA；③B5(MS)基本培养基+1.0mg/LBA+0.5mg/LNAA。3.5再生苗的生根及移栽将没有生根的再生苗转移至MS+0.2mg/LNAA生根培养基中生根壮苗。待根系发达移栽至蛭石：草炭土=3:1的基质中培养。4.结果(1)以胡萝卜子叶、下胚轴和直根形成层均可诱导出愈伤组织，其中以下胚轴诱导出的胚性愈伤组织最适合细胞悬浮培养。(2)诱导松散型愈伤组织最佳激素浓度配比为以MS或B5基本培养基加2，4-D0.1mg/L较好，最适温度为21℃~25℃，pH值为5.8。(3)在4次~5次继代时，细胞系趋于稳定。(4)细胞起始密度在1.125*104个/50mL~2.325*104个/50mL时，7d~9d为对数生长期。(5)悬浮细胞转入MS固体培养基，7天长出新的愈伤组织，30天长出全株，并移植蛭石成活，目前已经长出胡萝卜。5.分析及讨论5.1悬浮细胞系一个成功的悬浮细胞系一般来说具备以下3个特征:一是悬浮培养物分散性良好,细胞团较小；二是均一性好，细胞形状和细胞大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色彩呈鲜艳的乳白或淡黄色；三是细胞生长迅速。影响悬浮系建立的因素包括起始愈伤组织的质量，起始培养密度；培养基；培养条件如培养温度，继代周期、继代方式等。用于建立悬浮细胞系的愈伤组织要求分散性好，增殖快，再生能力强，一般来说其外观呈乳白色或淡黄色，松散易碎。由外植体诱导来的愈伤组织往往有多种类型，选择合适的愈伤组织类型或将已获得的愈伤组织进行巧妙的继代得到松散的胚性愈伤组织至关重要。该试验中，胡萝卜块根愈伤组织的诱导受基本培养基影响不大，而激素对愈伤组织的状态影响较大，以MS或B5基本培养基加2，4-D0.1mg/L较好。5.2诱导激素在许多植物品种的再生过程中，在分化培养基中添加适量的BA和NAA对分化是非常有利的，但胡萝卜愈伤组织的再生过程中BA和NAA的作用并不大，成苗非常慢，且再生频率低，而不添加任何激素的MS和B5基本培养基上，愈伤组织分化率高，且大多通过胚状体的方式成苗，这是因为胡萝卜愈伤组织和悬浮细胞系具有较强的胚胎发生能力，在无激素的培养基上容易成熟和萌发成苗。从总体看，胡萝卜愈伤组织出苗的时间相对较长，ABA可促进体细胞胚的成熟，在分化培养基中加入一定浓度的ABA是否可缩短胡萝卜愈伤组织成苗的时间,5.3悬液起始密度在悬浮细胞培养体系中，接种初期细胞起始密度对细胞的生长非常重要，只有当起始细胞密度超过细胞生长的某一临界密度时培养细胞才能生长，悬浮细胞的起始密度一般在（0.5～2.5)*10的5次方个/mL。5.4悬浮培养物继代的方法悬浮培养物继代的方法有多种,该试验采取了吸取法、静止法和瓶壁法等3种继代方式。吸取法通过吸取不同部分的培养物获得不一样的培养效果，吸取中间培养物继代可获得均一性好的单细胞或细胞团的悬浮细胞系，但增殖较慢，且在培养的初期不适宜使用此方法；吸取底部培养物继代吸取的细胞团较大，悬浮细胞团生长较快，往往接种后2～3d就进入对数生长期，但容易产生较大的细胞团。静止法相对于第2种吸取法来说，接种的悬浮细胞团小，生长速度也较快,接种后第4～5天便进入生长期，细胞团数目明显地多于吸取法的第1种方法，但悬浮培养物颗粒不如吸取法均匀。在植物细胞悬浮振荡培养过程中，植物细胞也具有贴壁生长的现象。瓶壁法是利用植物细胞培养这一现象而出现的新的继代方法，可获得高频率的、均一性好的单细胞悬浮细胞系。但采用此方法继代发现，胡萝卜悬浮振荡培养中瓶壁上的细胞圈细胞分散性并不是很好，有一定的粘性，转入新鲜培养基后通过振荡培养很难使其分散开来，且继代过程相对而言较为复杂，容易造成污染。因此，从总体效果看，胡萝卜悬浮培养物的继代可采用静止法，当然，不同植物材料，不同实验的要求可有针对性的选用。此试验正在进行中。该试验还发现，光照的强度和时间对胡萝卜愈伤组织的分化影响非常大，光照时间过长，强度过大，愈伤组织容易变紫或褐化。5.5无菌操作组培上常用的灭菌方法有物理和化学法。常用的物理方法有：物理灭菌干热、湿热、射线处理、物理除菌、过滤、离心、沉淀等。常用的化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌。不同的物品要选用不同的灭菌方法。实验室中常见仪器设备及其灭菌方法如下：（1）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法。具体方法如下：压力在9.8*104-10.8*104Pa，灭菌温度在121℃，灭菌20-30min。（2）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌、干热消毒灭菌。（3）塑料器皿灭菌：多采用高压蒸汽消毒灭菌（4）金属用具灭菌：灼烧灭菌。具体方法是：进入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用。（5）接种室杀菌：紫外线照射、空气消毒灭菌。超净工作台：紫外灯照射，70%-75%的酒精擦洗。（6）外植物体灭菌：水冲洗10—20min或更长的时间→70%-75%酒精中浸泡30s→0.1%-0.2%氯化汞液中浸泡10min左右→蒸馏水冲洗4-5次→备用。6.注意事项1、调节培养基时，理论上应调至5.8为宜，但因培养基经高温高压灭菌时，蔗糖分解，PH值会有所下降，因此调至6.0可减小误差。2.防火。实验中要经常用酒精消毒、用酒精灯烧镊子、刀具，注意安全。3.无菌操作。材料经HgCl2消毒后，即认为是消毒干净，此后的操作中的用具要求无菌。为防止染菌，注意：手要用酒精擦干净；镊子和刀经常在火焰上烧；锥形瓶、手不要放在盛材料的培养皿上方。4.废液处理。酒精要回收，放原处；HgCl2有剧毒，小心不要溅出，废液使用后应按要求放到指定位置。5.实验材料大小应适中，不宜太大或太小。6.实验中接种过程要在操净工作台进行，接种前，实验所用的所有器械及手均需严格消毒灭菌。7.切胡萝卜时，下面应垫上滤纸。8.接种时，动作要轻，力度适中。不要把接种的切块压入培养基里面，以致破坏培养基。9.接种时瓶口应倾斜45度，以免手、镊子上的赃物容易掉到三角瓶里。10.操作期间应经常用70%—75%的酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。11.灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸汽灭菌锅，使用时要注意以下几点：（1）锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；（2）装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空间，利于蒸汽流动；（3）增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响灭菌效果；（4）灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵守灭菌时间；（5）排气降压时应缓慢进行；（6）只有待高压锅内压力表指针恢复到零后，才能开启压力锅；(7）高压锅工作时，应有专人看守。12.培养基的保存应注意以下几点：（1）灭菌后的培养基经冷却和凝固后即可使用检验灭菌效果。检验是否无菌的方法：将培养基置于培养室中3天，若没有污染现象，说明灭菌可靠，可以使用。（2）保存在低温条件下。常温下保存时要进行防尘和避光处理。（3）保存时间不可过长。