胶质瘤细胞的培养及应用

胶质瘤细胞的培养及其应用【摘要】胶质瘤细胞及组织培养的方法日益成熟，近些年来有了一些新的改进，已经广泛应用于胶质瘤实验的多方面研究：放疗、化疗、生物治疗等方面细胞学实验以及动物模型的建立。【关键词】胶质瘤；细胞培养；应用据统计大约9%的人类肿瘤是脑肿瘤，而脑肿瘤中90%是胶质瘤［1］。脑胶质瘤是来源于神经上皮的肿瘤。在成人致命原发脑肿瘤中，高级别恶性胶质瘤最常见，确诊后中位生存期为9~12个月［2］，而且这些患者是经过积极治疗的，包括外科切除、放疗、化疗等。这些治疗的失败部分归咎于胶质瘤细胞侵袭性生长以及与周围正常脑组织交错，因而外科手术难以完全切除［3］；同时由于其异常的生物学特性，对放、化疗的抗拒，导致术后放、化疗失败；而且经常以同级别或高级别复发［4］。因此需要开辟新的治疗方法如生物治疗以及开发新的治疗药物，这些新的治疗方法及新药研制都需要以实验为依据。目前关于胶质瘤的常用研究方法有临床实验和基础实验。其中常用的基础实验有细胞实验以及动物实验。细胞学实验是基础，是利用培养的细胞进行实验，从细胞水平、分子水平揭示胶质瘤的细胞特性。它具有许多优点：可以长时间直接观察细胞的形态结构和生命活动［5］；研究的条件可以人为控制；研究的样本比较均一；研究的内容便于观察、检测和记录；可以用于许多领域的研究；相对而言比较经济。1胶质瘤细胞培养的历史1925年，Fish培养人恶性胶质瘤细胞获得成功，开创了体外研究胶质瘤的先河。Manuelidis于1959年建立的世界上第1个人胶质瘤细胞株TC178，使体外长期连续动态观察胶质瘤细胞成为可能。20世纪70年代以来，随着基础培养技术的迅猛发展，胶质瘤细胞的体外培养和克隆技术日趋成熟。近年来更是探索出许多新的培养方法，并应用于各项研究。目前胶质瘤的细胞培养技术比较成熟，已经建立了许多胶质瘤品系，如国内的人脑恶性胶质瘤体外细胞系SHG-44，是1980年取材于额叶星形细胞瘤的组织块经胰酶消化，单层静止培养而成的；细胞形态有星形、梭形；流式细胞光度仪测定，此细胞以四倍体为主，G1期占54.57%、S期占15.17%、G2/M期占30.25%；免疫组化提示本细胞中存在S-100和GFAP；存于苏州大学附属第一医院神经外科细胞实验室。已经明确的胶质瘤细胞系（株）有许多，有人型、鼠型等，如U251、U87、U118、T98、TJ899、TJ905、D54、NT325、CHG5、BT325、9L、C6等，而且今后还会不断建立新的品系。2目前常用培养方法及应用现有的胶质瘤细胞培养形式主要有：单层细胞培养、三维/立体培养及联合培养等。2.1单层细胞培养及应用传统意义上的单层细胞培养可以分为原代培养以及传代培养两类。前者是从供体获得组织后的初次培养，后者一般为利用现有的细胞系（株）。两种培养方法各有优缺点，而且都已经得到广泛的应用。目前国内研究胶质瘤的实验多采用细胞系，这主要是因为国内已经有许多胶质瘤细胞系，品系明确、易于培养；但连续性细胞系由于连续传代，细胞的形态、结构、功能发生了一定的变化，传代代数越多，发生的变化也越大，因而对实验结果有一定的影响。原代培养细胞技术相对要复杂得多，而且培养成功率较低，费时费力，因此不为许多研究者选用；但原代细胞刚离体，在形状、结构、功能等方面与体内细胞更接近，相对能更好地代表其来源组织的细胞类型及组织特异性，更好地保留胶质瘤的生物学特性，更接近也更能反映体内生长特性，所以原代培养出的细胞更适合做药物敏感实验、放射敏感实验等基础实验研究。原代单层细胞培养常用的方法有：组织块原代培养以及单细胞悬液法培养。前者是将胶质瘤组织块贴附在培养瓶（板）上，一般1~2天就会有细胞从组织块边缘游出，利用游出的细胞进行培养；后者是将组织块通过机械分离或酶消化法或者二者结合的方法分离成单细胞悬液，再接种于培养瓶（板）进行培养的方法［6,7］。传代单层细胞培养的方法相对简单一些，只需将需要传代的细胞用胰蛋白酶消化吹打后，按需要接种于培养瓶内，补足培养液即可。以上为传统的细胞培养方法，在此基础上又发展出一些培养方法，如：单细胞分离培养法、加支持物培养法、球体细胞培养法、悬浮培养法等。单细胞分离培养也就是克隆培养，国内孙立军、黄强等［8］已经通过对SHG-44细胞系单克隆化，建立了具有低、中、高3种不同分化程度的人胶质瘤细胞株。加支持物培养法是为了实验研究或便于观察而预先向培养瓶/板内加入支持物；如为了做细胞免疫组化，预先在培养板内放入小玻片，再培养细胞，待细胞长在玻片上，取出固定、染色，也称为爬片。球体细胞培养是将长成片的细胞移入不易贴附的底物上，则细胞片能卷聚生长成球形。悬浮培养法，顾名思义就是让原本贴壁生长的细胞悬浮生长。李茗初等［9］运用无血清培养基悬浮培养C6胶质瘤细胞系，从中分离出该细胞系的干细胞。单层细胞培养是目前最常用的一种培养方式，已广泛应用于各项基础研究。2.1.1在放射治疗研究中的应用目前胶质瘤细胞系众多，不同细胞系有各自不同的特点，如MO54对辐射敏感，而T98则对辐射抵抗［10］；U373、U251、U118MGT-98G表达突变型p53，而U87、D54、A172、CCF-STTG1细胞表达野生型p53。针对不同细胞系的特点，在实验研究时可以根据需要而加以选择。Ostruszka等［11］在研究细胞周期进程中由2,2-二氟脱氧胞嘧啶核苷(2′,2′-difluoro-2′-deoxycytidine;dFdCyd)引起的放射敏感性的作用中运用了2种人胶质瘤细胞系U251和D54，并且发现U251对dFdCyd的细胞毒性更敏感，dFdCyd也是U251的放射增敏剂，这种差异在于U251表达突变型p53，而D54细胞表达野生型p53，在D54细胞联合dFdCyd和电离辐射后，突出表现在G1期阻滞。Chen等［12］在研究DB-67作为一种新型DNA拓扑异构酶具有靶向辐射增敏剂的研究中也运用了表达野生型p53和突变型p53的D54-MG和T-98G胶质瘤细胞系。Shono等［13］采用将腺病毒载体-p53(Ad-p53)导入表达突变型p53的胶质瘤细胞系U251、U373和表达野生型p53的U87、D54细胞系，Ad-p53能通过增加表达野生型p53胶质瘤细胞的凋亡趋势来提高它们的放射敏感性，并进一步揭示Ad-p53转染的人胶质瘤细胞所诱导的凋亡和磷酸化区域特异性的位点相关。2.1.2在化疗药物研究中的应用胶质瘤化疗效果差，这主要与缺乏有效的化疗药、全身化疗时化疗药难以通过血脑屏障以及肿瘤耐药有关。因此胶质瘤细胞培养广泛应用于新药开发。Das等［14］用U87-MG研究地塞米松能够通过维持Bax:Bcl比率来保护人胶质瘤细胞U87-MG免于遭受替莫唑胺诱导的凋亡，提示胶质瘤患者接受替莫唑胺化疗之前如果用地塞米松将会产生非预期效果，为指导临床治疗打下基础。Landen等［15］在研究那可丁通过血脑屏障及抑制胶质瘤生长时利用鼠C6细胞系，证明那可丁可以抑制C6细胞增殖，并测定那可丁通过一层培养的脑微血管内皮细胞比率，并且与已知的渗透剂和非渗透剂相比较，来作为体外测定那可丁通过血脑屏障的方法。2.1.3在生物和基因治疗研究中的应用生物治疗主要是通过调动宿主天然防卫机制或给予机体某些物质来取得抗肿瘤效应。对抗肿瘤防御机制的基础理论的深入了解以及生物反应调节剂（BRMs）的不断发现和应用使得生物治疗前景广阔。BRMs大致有以下几类：天然或基因重组细胞因子、抗肿瘤的各类体细胞和辅助性的造血干细胞、抗体、基因治疗、肿瘤疫苗、抗血管生成药、细胞分化诱导剂、某些菌类及其有效成分、植物药包括中药的有效成分、有机酸及小分子合成剂、其他类型。随着生物治疗研究的不断升温，胶质瘤的细胞培养已广泛应用于胶质瘤生物治疗的许多方面，如：Friese等［16］利用人胶质瘤细胞系和鼠胶质瘤细胞系GL261和SMA-560研究NKG2D，肿瘤细胞表达的配体激活免疫受体NKG2D刺激由NK、γδT和CD8+T细胞介导的肿瘤免疫。人胶质瘤细胞表达NKG2D的配体MICA、MICB和一些UL16-结合蛋白家族，然而胶质瘤细胞因为高表达Ⅰ型MHC抗原而抵抗NK细胞的细胞毒作用，体外实验中质粒介导或腺病毒介导在胶质瘤细胞过表达的MICA可提高它们对NK和T细胞的应答。肿瘤疫苗也是当今研究热点之一，制备以及测试抗胶质瘤疫苗都需要胶质瘤细胞培养。如利用胶质瘤细胞致敏树突状细胞（dendriticcells，DCs）制备胶质瘤疫苗。Driessens等［17］发现被γ射线或化疗药（顺铂和丝裂霉素）作用后凋亡的胶质瘤9L细胞联合鼠来源的成熟DCs分泌GM-CSF显示较好的治疗肿瘤潜能。Giezeman-Smits等［18］发现用白介素-4(IL-4)转染胶质瘤9L细胞制备的肿瘤疫苗能够诱导亲代肿瘤发生特异的、有保护性的免疫应答。针对胶质瘤基因治疗的研究也越来越多，如单纯疱疹病毒胸腺激酶(HSV-TK)基因/丙氧鸟苷(GCV)系统、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(Ec-CD)基因/5氟胞嘧啶(5-FC)系统；早期生长反应基因-1启动子（pEgr-1）；CEA-启动子等［19~22］。2.1.4在动物模型研究中的应用培养的胶质瘤细胞还可以用于建立动物模型，为研究胶质瘤发病机理以及治疗提供良好的实验对象。如利用鼠类细胞系立体定向注射于大鼠颅内建立鼠胶质瘤模型等。Prins等［23］通过向C57BL/6(H-2b)雌鼠的腹侧皮下注射GL26胶质瘤细胞以及将GL26胶质瘤细胞立体定向注射于大鼠颅内建立鼠胶质瘤模型，用于研究黑色素瘤相关抗原（MMAs）的靶向免疫治疗。2.1.5在其他方面研究中的应用胶质瘤细胞培养除用于上述研究外，还广泛应用于其他研究方面，如探讨胶质瘤细胞与正常星型细胞之间的作用机制；胶质瘤细胞凋亡机制以及侵袭转移机制等。Zhang等［6］在研究恶性胶质瘤细胞和星型细胞之间的直接缝隙连接的交流中采用了原代培养的胶质瘤细胞和原代培养的星型细胞。Joy等［3］利用SF767和T98G胶质瘤细胞系研究发现恶性胶质瘤细胞激活P13-K途径并且表现降低凋亡的敏感性。Yamamoto等［24］利用SNB-19、D-54MGU、87MG、U-373MG、U-118MG和SW1088研究N-glycan在调节胶质瘤迁移和侵袭中的作用。2.2三维（立体）培养及应用单层细胞培养虽然已经得以广泛应用，但也有其不足之处：第一，具有遗传不稳定性；第二，是一个平面结构，而人体是三维立体结构，与人体环境相差很远。针对这些不足，许多科研工作者也尝试用立体培养，因为环境对细胞的生长分化有着至关重要的作用。已有科研证明异位植入的胚胎细胞能转化为恶性细胞，并引发癌症，而相同的细胞在子宫内则可形成正常的胚胎；相反畸胎瘤细胞植入胚胎内可能经历正常的发育过程。与传统的培养方式相比，三维立体培养的细胞在细胞形状和细胞环境更接近于活体内状态，而形状和环境能决定细胞的基因表达和生物学行为。三维细胞培养优点还在于具有清晰的几何学形状，这使其结构与功能直接相关，从而可以进行理论分析［25］。Joki等［26］在研究环氧化酶-2的实验中运用了三维培养系统，证明环氧化酶-2抑制剂NS-398对胶质瘤细胞生长和迁移有抑制作用。但是三维立体培养也不能完全模拟体内环境，而且立体培养的模型在目前条件下难以无限生长下去，主要是因为模型长到一定大小时，由于模型中心缺乏营养或缺氧而坏死。因此如何解决这些问题，还需要进一步努力。2.3其他培养方法及应用目前培养和应用胶质瘤细胞除了单独应用上述培养方法以外，还有共培养（coculture）方法,即将2种或2种以上的细胞一起培养的方法，其实质也是单层细胞培养；也有尝试2种或几种方法联合应用，如同时选用单层细胞培养及三维立体培养。Zhang等［6］将原代培养的人胶质瘤细胞和原代培养的鼠星型细胞共培养，并认为2种细胞之间的缝隙连接的形成不是自然的，因为将胶质瘤细胞注射入活鼠脑内很快就能和宿主细胞功能性耦联在一起，而且和胶质瘤细胞耦联在一起的缝隙连接似乎可以调