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生物药剂学与药物动力学1脂质体对于亲核一氧化氮供体的包囊作用对一氧化氮供体稳定和呈递的增强刘禹嘉付玉颖邵倩西南大学药学院400715摘要：一氧化氮（NO）供体在水相环境中的迅速分解存有应用限制。因此在本文中，我们研究二棕榈酰卵磷脂依赖型脂质体组织对NO释放的增强作用。与自由NO供体比较，脂质体内NO供体的包囊作用能够同时延长NO释放和提高NO存储。NO释放脂质体也在对抗人胰腺癌细胞上有较高效率。NO释放媒介展现了有效负荷大部分NO的潜力，因此这些NO释放媒介有积极的抗癌疗效。关键字：一氧化氮控释给药脂质体癌症1简介NO有抗血栓性质，也是先天免疫应答的中心，同时也表现出广谱抗生素活性。然而NO的半衰期较短，并在生物媒介中发生反应，这使NO供体成为必要。NO供体的NO释放机制形成了NO释放动力学。由多NO供体组成的高分子NO释放支架已实现更大的有效载荷和传递。本文预计下一代NO释放支架会更稳定，或仅在pH7.4和37°C时微破裂，直到特定环境(如ph值的变化)引发NO大量释放。利用肿瘤内酸性(pH5.4−7.6)微环境，这种ph值触发的NO释放可能在发展的新抗癌剂方面有重要作用。脂质体是由磷脂双分子环绕的水溶液内芯组成的纳米结构，NO释放铬-脂质体络合物的包囊作用证明磷脂双分子可以提高NO供体的稳定性，这种包囊作用是利用薄膜水化法实现的。在此，我们介绍一种制备NO释放脂质体的方法，包括亲核一氧化氮供体的媒介形成、稳定性和ph值触发传递。2方法2.1亲核一氧化碳供体的合成在真空状态下分解前体分子。最终产物存储在−20°C下备用。生物药剂学与药物动力学22.2脂质体的制备脂质溶解于体积比例为1:1的氯仿-异丙基醚溶液，添加到有氮气层隔膜的圆底烧瓶中。取亲核一氧化氮供体在NaOH中制成14mMNO供体溶液，注射到烧瓶中，45°C造影4min。有机相通过旋转蒸发除去，脂质体产物在45°C保存30min。原料使用10mL注射器和葡聚糖凝胶G-25离心柱浓缩脂质体。最终脂质体溶液在4°C避光保存。2.3脂质体大小特性经稀释的脂质体在热塑树脂覆盖的透射电子显微镜方形铜网上投影。采用2%醋酸双氧铀进行负染色。染色剂在网格上留存一分钟，再使用滤纸除去，进行15分钟的干燥。脂质体使用日本电子100CXII透射电镜在100kV加速电压下成像。2.4磷脂含量检验最终脂质体中总磷脂含量的测定采用斯图尔特检测法。将1微升的脂质体与1.999毫升硫氰铁胺溶液混合。随后，加入2mL氯仿，涡旋15秒。在116Xg条件下离心5min，在485nm处进行紫外可见吸收光谱分析。2.5脂质体中一氧化氮的释放用Sievers(Boulder,CO)NO分析仪分析脂质体中NO总数并对释放动力学进行评估。用没有过滤的NO和在26.80ppm条件下过滤的标准NO对仪器进行校准。NO分析前，脂质体中所有可能渗透进脂质体双分子层存储的材料已经过交联葡聚糖G-25核酸纯化柱滤除，通过纯化柱后，将部分脂质体注入乙醇与0.183M硫酸体积比为2:1(30毫升总量)的混合液中，37℃测定封装效率。37℃下对10mM醋酸缓冲液（pH5.4）和10mMPBS（pH7.4）进行动力学研究。2.6细胞毒性试验PANC-1细胞在添加10vol%FBS和1wt%青霉素链霉素的DMEM培养。细胞培养在37℃5%CO2的加湿孵化器中。用不同容量的药物和三复孔治疗细胞。37℃下培养24小时后清除每孔的上层清液，冲洗清除任何所有脂质体,并添加DMEM（100uL），加入20uL的MTS试剂(20:1v/vMTStoPMS)37℃90min内进一步孵化。随后，将上层液转移添加到一个新的96孔板中。最后在490nm处用温控酶标仪测出吸光度。样本和标准品之间吸光度的比值乘以100确定细胞生存能力的百分比。生物药剂学与药物动力学33结果和讨论3.1NO释放脂质体的合成通过溶解精胺/一氧化氮或者二丙烯三胺/一氧化氮于氢氧化钠中合成NO释放脂质体,方法是添加二棕榈酰磷脂酰胆碱/胆固醇有机混合物并短暂超声处理形成乳状液。通过透射电镜进检测到脂质体的形成。3.2脂质体释放一氧化氮测量在生理条件下通过改变低分子量NO供体的选择性封装使得一氧化氮实现了释放可调性。在pH5.4醋酸缓冲液下动态光散射分析脂质体的实验表明脂质体的大小和形状被保留，我们推断NO释放动力学的速度一定是大量质子涌入的结果。NO释放加快是因为NO供体降解加快，与脂质双分子层被破坏无关。3.3NO释放脂质体的稳定性随时间的变化对NO释放脂质体进行评价时，以pH为函数进行评价。对NO脂质体在制备好的PBS（PH7.4）NaOH（PH12）硼酸缓冲溶液（PH9.0）等溶液内的剩余含量进行动态监测。4℃条件下储存3个月，65%的PBS与硼酸缓冲液储存了NO。很明显，碱性条件下，NO供体拥有最大稳定限度。3.4DPTA/NO脂质体的细胞毒性根据人类PANC-1胰腺癌细胞的抗癌作用来衡量游离DPTA/NO和DPTA/NO脂质体的细生物药剂学与药物动力学4胞毒性.结果表明在自由NO供体系统中存在潜在的治疗作用，其中NO用于诱导对胰腺癌细胞的细胞毒性作用。4结论制备NO释放脂质体时，利用碱性环境可以延长不同浓度NO约三个月的保质期。初步研究表明NO脂质体可以作为抗癌药物用于治疗，但仅限于小分子NO供体。脂质双分子层的组成是可变的，例如磷脂组成，电荷等。未来研究中可以利用热稳定性较好的介质如1,2二硬酯酸-3磷脂酰乙醇胺等来进一步延长NO的释放时间，从而增大脂质双分子层的刚度。