重组腺病毒构建,扩增及纯化基本技术操作(细菌内同源重组AdEasySystem)一目的基因的克隆(以pshuttle-CMV质粒为例)1.选择适当酶切位点,进行酶切连接,将目的片段插入pshuttl-CMV质粒多克隆位点。2.重组质粒鉴定:酶切鉴定或测序。3.重组质粒扩增,纯化并准备适量含目的基因的穿梭质粒。4.用PmeI单酶切线性化重组穿梭质粒,电泳鉴定质粒完全被切开。5.胶回收线性化质粒,以备共转化使用。二共转化1大肠杆菌BJ5183电转感受态制备²从新鲜琼脂板上挑取单个BJ5183细菌,接种于LB培养基中,37℃振摇过夜。²接种25ml过夜培养物于500mlLB培养基,37℃振摇,至OD600达到0.4。²迅速将培养物置于冰浴中30min,至充分冷却。²将菌液转移至预冷的离心管中,4℃下以2500r/min离心15min,弃培养液,回收细胞。²以10ml预冷的10%甘油洗涤沉淀,低温离心,共两次。²加约1ml(适量)预冷的10%甘油重悬沉淀,稀释悬液100倍,测量OD600,至稀释浓度为2-3×1010个细胞/ml(1.0OD600约2.5×1010个细胞/ml)。分装,-80℃或液氮保存待用。2病毒骨架质粒转化大肠杆菌,扩增,纯化。3将1-5µl(约1µg)线性化的穿梭质粒及1µl(约100ng/µl)病毒骨架质粒(如pAdEasy-1)加入至含约40µlBJ5183电转感受态的EP管中混匀,冰上冷却。4将混合物加入电转杯,电击(1250-1500V/mm,5ms)。5电击结束取出样品,加入1mlSOC或LB培养液,37℃低速振荡40min。6取适当体积的电击转化细胞液涂于数个卡那霉素抗性平板(25-50mg/ml),37℃培养16-20hr。7次日挑取平板上长出的菌落(选择最小的菌落),接种于3ml含25-50mg/ml的LB培养基,37℃培养10-15hr。8碱裂法提取质粒,0.8%琼脂糖凝胶电泳筛选,大质粒为可能阳性克隆,进一步酶切鉴定。以PacI单酶切,0.8%琼脂糖凝胶电泳如显示出一条大片段(约30kb),及一条小片段(约3.0或4.5kb)(同时可进行其它酶切鉴定),则基本确定为阳性克隆。9取1-5µl阳性质粒转化至DH5α大肠杆菌细胞(BJ5183为recA+,质粒DNA易发生突变,DH5α或JM109,XL1-blue菌株为重组缺陷性菌株,可稳定扩增已鉴定的重组质粒),扩增细菌并纯化质粒。三重组病毒质粒转导293细胞1293细胞培养:转导24小时前,以方瓶为例,接种2×106293细胞于25cm2方瓶,使生长密度约50-70%。(也可以使用6孔或96孔板)2以PacI单酶切重组病毒质粒(转导25cm2方瓶约需4µgDNA),完全线性化后,乙醇沉淀,再以20µlddH2O溶解。3脂质体包裹质粒(以Lipofectamine为例):每4µgPacI约需20µlLipofectamine包裹.质粒及脂质体分别稀释于500µl无血清培养基再混合,置于室温下15-30min。4以无血清培养基轻轻洗涤培养瓶,另加2.5ml无血清培养基,37℃放置10min。5将Lipofectamine-DNA混合物加入培养瓶,37℃孵箱放置4hr。64hr后,弃Lipofectamine-DNA混合液,另加入6mlDMEM完全培养基(含10%FCS)。如有大量细胞漂浮,可不弃Lipofectamine-DNA液,加入6mlDMEM完全培养基,37℃孵育过夜,再换液。7培养过程中观察细胞生长情况。约2周后可观察到细胞病变(CPE)出现(如用pAdTrack-CMV质粒,由于含GFP,可观察到绿色荧光)。四重组病毒鉴定1转导10-14d后,收集细胞沉淀,加入2ml灭菌的PBS混悬,冻融细胞,离心后收集上清保存于-80℃。2取30-50%步骤1中上清,感染50-70%饱和度的25cm2方瓶中293细胞。2-3d后出现明显细胞病变。3感染后3-5d,当1/3-1/2细胞漂浮时收集病毒。按步骤1收集细胞并准备病毒上清。通过Westernblot和/或PCR鉴定重组腺病毒产生。4PCR鉴定重组病毒。取5µl病毒上清加入10µl蛋白酶K,55℃孵育1hr,再煮沸5min,离心后取1-2µl作PCR。五重组病毒扩增,纯化175cm2方瓶中接种293细胞,至密度达到90%,加入适量病毒上清感染细胞。3-4d后,细胞几乎变圆,且有一半细胞漂浮,则收集所有细胞。约500g转速离心,弃上清。2以灭菌PBS重悬沉淀,反复冻融4次。4℃下7000g离心5min.病毒纯化至少需要30瓶75cm2方瓶细胞。3CsCl连续梯度离心纯化:50ml离心管中称量4.4gCsCl,加入8ml病毒裂解上清液,混匀,体积约为10ml。转移至12ml超速离心管(用于SW41转头)中,覆盖约2ml矿物油。平衡后,10℃下32000rpm离心18-24hr,用注射器抽吸离心出的病毒带。(也可CsCl不连续梯度离心:20ml超速离心管中缓慢加入8mlCsCl1.4(53g+87mL10mMTris-HCl,pH=7.9),上面小心加入6mLCsCl1.2(26.8g+92mL10mMTris-HCl,pH=7.9),再小心加入病毒上清液至体积达到20ml。平衡后,4℃下23000rpm离心90min(SW28转头),用注射器抽吸下层蓝白色病毒带)4病毒透析去盐:配置透析液(10mMTrispH8.0,2mMMgCl2,5%sucrose),灭菌处理。4℃透析,更换3次透析液,可基本去除CsCl,病毒保存于-80℃。六病毒滴度测定(TCID50)1细胞准备:96孔板中接种100µl293细胞,每孔细胞数约104个,以2%DMEM培养2稀释病毒液准备:以2%DMEM将病毒液稀释成8个较高浓度(如10-3-10-10),每个浓度重复10个,每孔加入病毒稀释液100µl。另留两排不加病毒液作为阴性对照。37℃下,孵箱培养10天。310d后观察细胞,记数每排出现CPE的孔数,计算细胞病变率。(如某一浓度各孔细胞全部病变,比率为1,如无细胞病变,则比率为0)。4计算T=10×101+d(S-0.5)/mld=Log10稀释度(如为10倍稀释℃,d=1)S=各浓℃细胞病变比率之和实验室重组腺病毒常用质粒:病毒骨架质粒:pAdEasy-1,pAdEasy-2穿梭质粒:p-Shuttle,p-Shuttle-CMV,pAdTrack,pAdTrack-CMV腺病毒的包装,纯化和感染技术背景:Adeasy系统利用了腺病毒具有的高感染能力,可高度浓缩等优点,并破坏了腺病毒基因组中的早期基因E1,使之成为较为安全、高效的病毒载体。利用带有E1基因的293细胞作为包装细胞,通过倍比扩增,富集病毒颗粒,并通过CsCl梯度离心,透析进行分离纯化。对绝大多数的细胞株可以达到近乎100%的感染效率。但需要指出的是Adeasy同样具有所有病毒载体或转染试剂都不可避免的细胞毒性问题。所需试剂:?293细胞;?重组好的腺病毒质粒;?PacI限制性内切酶;?质粒回收相关试剂;?细胞培养、转染相关试剂;?TBS:10mMTris,0.9%NaCl,pH8.1;?40%CsCl:28.45gCsCl溶于42.7ml的TBS中,4度保存;?15%CsCl:9.085gCsCl溶于47.69ml的TBS中,4度保存;?Beckman离心管:14*89mm,SW41转头;?Polybrene(sigma),10mg/ml;?透析袋:SpectrumCo.(成卷供应,带少量甘油,硫化物与重金属),MW=8000~14400;?灭菌甘油。操作流程:1.293细胞(E1-transformedhumanembryonickidneycells在转染前24小时接种于1或2个60mm培养盘中,使之在转染时细胞汇合率为50-70%;2.在转染前,用PacI处理目的质粒(一般一个60mm细胞盘需要6μgDNA)。处理后质粒用乙醇沉淀并重悬于20μl无菌水中;3.用PEI或其他转染试剂将6μgPacI处理过的质粒转染细胞;14.8个小时后移去混合液,加入4mlDMEM完全培养液(10%CBS,1%Pen/Strep);5.在转染后7到10天用细胞刮(而不是胰酶)将细胞从瓶中刮下并移入50ml锥形管。离心后将细胞重悬于2.0mlPBS或全培液中。于液氮中冻结细胞,37℃水浴中溶解,剧烈振荡。此步骤共进行4次。注意保存时不要反复冻融,可保存于-20℃;6.将293细胞以50-70%的汇合率铺于60mm培养盘中,以30-50%的体积比加入含病毒上清液。在感染后2-3天即可看到明显的细胞裂解或CPE现象;7.在有1/3到1/2的细胞脱离漂浮时,通常是感染后3-5天收集病毒。可进一步通过Westernblot或PCR(5μl病毒上清加上10μlPCR-gradeProteaseK,55℃消化1小时,然后煮沸样品5min,离心后取1-2μl进行PCR反应)证实重组腺病毒的存在;78.按步骤5的方法收集病毒上清。在这种情况下一般至少可收集到10infectiousparticles/ml的病毒。每轮的扩增应能提高一个数量级的梯度;9.为了进一步扩增,将步骤8获得的病毒上清进一步感染100mm培养盘的细胞,按步骤5的方法收集病毒,并进而将其感染150mm细胞培养盘中的293细胞,以获得足够量的病毒;10.将15%CsCl和40%CsCl加入Beckman离心管中制备CsCl梯度溶液;11.将最终富集病毒颗粒的病毒上清滴加于CsCl梯度溶液上;12.超速离心,30000rpm,4度离心16个小时;13.离心后,应有两条带。位置较高,颜色较弱的条带主要为腺病毒空壳,不具感染能力;位置较低,颜色较亮的条带含有我们需要收集的活病毒颗粒。用16号针头将这一条带收集;14.在TBS中透析一小时,随后在含有10%甘油的TBS中透析两次,每次一小时;15.将纯化的腺病毒分装于EP管中;16.在EppendorfBiophotometer中测量透析液中的总蛋白量,1μg病毒蛋白相当于4×109病毒颗粒;17.长期保存于-70度中,短期可保存于4度,切忌反复冻溶;218.由于腺病毒对不同细胞株的感染效率存在差异,且考虑到病毒颗粒的细胞毒副作用,通常通过梯度感染的方法确定所需的病毒用量。以相对细胞数1:1,10:1,100:1,1000:1的病毒颗粒感染靶细胞;加入相对培养液体积1:1000的Polybrene。在37度下平板离心30分钟;19.感染8~12小时后换液。将含有病毒的培养液小心移入含有消毒液的废液缸中,加入适量全培液。参考文献:1.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.95,pp.2509–2514,March1998,Asimplifiedsystemforgeneratingrecombinantadenoviruses.2.CurrentProtocolsinHumanGenetics(2004)12.4.1-12.4.25.病毒感染力的滴定(TCID50的测定)实验操作步骤、计算方法2009-11-2815:20一、实验目的了解病毒感染力测定的几种常用方法,掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。二、测定病毒感染力的方法半数致死量LD50(50%lethaldose):用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量EID50(egg50%infectivedose):用鸡胚来检测半数细胞培养物感染量TCID50(50%tissuecultureinfectivedose):用细胞来检测蚀斑形成单位(plaqueformingunit,PFU):用细胞来检测三、材料1、长满单层的
本文标题:腺病毒的扩增及纯化
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