膜片钳之仪器操作与维护篇

膜片钳之仪器操作与维护篇1、电极一旦拉制成功后，其尖端必须作进一步的处理。目的之一是为了减小电极内部与溶液之间的电容，即在电极末梢前数微米处，涂敷一层疏水材料，如硅酮树脂（Sylgard）。这种物质能够防止液膜爬上电极。另一目的是为了对电极尖端作优化处理，如同热抛光的方法使电极尖端光滑、周围均匀，以提高实验过程中的封接成功率。2、关于电极的问题a.洁净的电极是封接的关键。电极需要在使用前拉制完成放在密闭容器中，通常在12小时内用掉比较好；b.内液（确切的说是电极液）需要过滤；c.在电极入水之前可以加一个正压，可以吹开电极尖端的液体及灰尘；d.如果不用灌流的话，最好bathsolution也要过滤。e、电极拉制成功以后，常置于一有盖的容器内，2-3小时内必须使用，电极使用前要进行充灌。在充灌前，电极内液要用0.2um的滤膜或滤纸进行过滤。利用玻璃管的虹吸作用，溶液可从电极尖端吸入，也可利用5ml注射器在尾端加负压以实现充灌，随后电极从尾端充灌。电极内液不能漏到夹持器，会使其内表面变湿形成薄膜从而产生热噪声，在充灌时，电极内出现的气泡可以通过轻敲电极而消失。3、降低噪声的关键是地线和屏蔽，第一地线接地要好；第二要注意将一些容易产生噪声的设备屏蔽好，比如显微镜灯光的电源、电动微超的马达、监视和记录的电脑以及一些可能产生噪声的电源线，总之你可以用排除法一一试验，肯定会降低噪声的，一般降低到几个pA/fA级即可。另外，你的负压也可以用一个“U”形管通过3通管加上。我认为屏蔽很重要哦，以前我在实验中，常遇到电极入水后方波有50HZ干扰，有时还跳动，很是心烦，想了很多办法就是去不掉，包括接地线，镀银丝、参比电极，清洗Holder等等，甚至怀疑仪器有问题，感到有些绝望了！后来发现灌流时干扰明显，把灌流装置控制电源搬到法拉第笼子外，一切就ok了！而且发现只要有电源线进入屏蔽笼，即使没有通电，也有交流干扰，所以所有进入屏蔽笼的电源线都应该用屏蔽线（而不是一般电线）。我体会到在膜片钳实验中一定要“消灭”各种干扰，这样结果才可靠，而消除干扰靠什么？Itis屏蔽！你可以用做铁笼子的铁丝网罩住显微镜电源，若没有屏蔽线，可以用保鲜用的锡纸包裹导线，只要是pA/fA就可以做了！4、关于干扰的问题我有以下几点看法：a、屏蔽室是必要的，尽管有时候看起来作用不大，但是如果外界的电磁干扰很大，这时候它的作用就显示出来了。b、避免干扰的一个原则就是要将屏蔽室内外的各个可能产生电磁干扰的仪器一定要接地，有时候一个仪器有好几个零部件，有些部件之间是绝缘的，此时就要将绝缘的部分分别都接地。c、同一个部件不要重复接地，有时候也可能产生干扰的。d、关于显微镜的问题：屏蔽到是没有必要，只要两根线就解决了1）将显微镜的灯罩打开，在内部的螺丝上接出一根线2）在显微镜的臂上的螺丝上接一根线e、此外，浴槽电极与灌流液一定要接触良好，否则的话也会出现干扰的，有时候开始还挺好，几乎没有干扰，但是在记录的过程中自己什么也没有动，就突然出现干扰了，很大的一部分原因就在此。这个问题曾经也是困扰了我好长时间，体会很深的。f、接地线到是没有特殊的要求，只要一般的电线就可以了g、不要让液体流出来（包括灌流和引流的液体），淌到实验台上或是地面上，这也是产生干扰的一个重要的原因。h、我也很赞成开心果果的意见，实验台和实验仪器一定要整齐有序，恐怕每个实验室也都是这样要求的吧5、屏蔽线就是用铜网屏蔽电源线，电子市场有卖的。一般用两相线，外面包有一层铜网，需要注意的是：（1）电线规格，我们用的电线直径0.75，这对220V足够了，太细满足不了仪器负荷。（2）屏蔽线的连接，一端接插头的零线，另一端接仪器的外壳（零线），且插座零线要接地（不能虚设）。（3）电线接头处要连接紧密，并用热缩管套牢。6、只要灌流装置电源线没有很好屏蔽，即使拔掉插头，仍然有干扰，不信你试着在有干扰时把灌流装置搬离法拉第笼子，看看有什么效果？这种方法就叫排除法（把法拉第笼里的有可能产生干扰的东西一件一件地搬出来，逐渐排除）。浴槽电极与灌流液一定要接触良好，否则的话也会出现干扰的，我也遇到过这种情况，建议大家在实验前把浴槽电极固定好。7、我认识美国KANSAS大学的一位做膜片钳的教授，他说他的实验室就不用屏蔽，已经运转了十多年了，也没有什么问题。他建议我们也不要用屏蔽，我不知道这样做是否可行，或者国外的实验室本身就与国内不同，他们能不用屏蔽，但我们就不行。说实话，我也认为没有屏蔽怎么可能，但的确开始的时候是没有噪音干扰的，后来也出现了一些噪音，我想屏蔽的作用应该是不可忽视的！8、硫酸镁和氯化钙其实都是ACSF中的成分，只是我们先把他们配成水溶液，因为如果以固体形式和ACSF中的其他成分一起配制，会产生碳酸镁和碳酸钙沉淀。9、前两天在安装HOLDER的时候，把银丝弄断了，我去外面的金银商店做了一根，好象比以前的粗一些，弹性不是很好，镀银以后装上去使用，想问问各位，这样是不是回对实验本身产生影响呢？膜片钳的每一部分最好都是厂家的原装产品，尽管银丝是很普通的东西，但在作工和规格上应该还是有差异的。你可以向厂家说明一下情况，向他们索要或购买比较好。10、玻璃微电极：常用尖端0.5-5μm，向细胞内插入时，需小于0.5μm（细胞直径的1/10~1/100），且尖端的倾斜度应相当缓和，一般微电极可分为金属微电极和玻璃微电极两类。金属微电极，现多用镀铂钨丝电极（platinum-platedtungstenelectrode），在钨丝上镀铂，可极大改善电极的电学特性，噪声可大大降低，加之机械强度大，适合长期体外记录（paréD，GaudreauH.Projectioncellsandinterneuronsofthelateralandbasolateralamygdala:distinctfiringpatternsanddifferentialrelationtothetheraanddeltarhythmsinconsciouscats.JNeursci,1996,16(10):3334-3350现要也常用镀银碳纤维电极。玻璃微电极记录易受机械位移的影响，加之尖端的电解质会漏出或堵塞，不适合半小时以上的长时间记录，玻璃微电极可分单管和多管微电极。11、毛坯管在国外多用Pyrex管，国内多用GG-17和95料玻管。细胞外记录多采用外径1.5-2mm玻璃，细胞内记录则采用外径1mm细玻管，内外径之比约为2：3或5：6，长6-8cm。拉制前必须经过清洁处理。玻璃毛坯管分为两类：软玻璃（苏打玻璃、电石玻璃）和硬玻璃（硼酸玻璃、铝硅玻璃、石英玻璃）。软玻璃熔点低，易于抛光处理，拉制成功后，有1-2MΩ的电阻，这种电极常用于作全细胞记录，其串联电阻或说得确切一点，噪声高低是一个限制因素。软玻璃较大的介电松弛特性，有时也产生电容瞬态分量，从而影响电容补偿的效果。硬质玻璃微电极拉制成具有较窄的末梢，因而具有较高的电阻。硬质玻璃具有较好的噪声和介电松弛特性；介电损失参数，这个参数描述玻璃的交流电导率。软玻璃在1KHZ的电导率，足以构成膜片记录中的主要热噪声源。硅硼和铝硅玻璃的介质损失低，是低噪声记录的理想电极玻璃。石英玻璃特别适用于作低噪声记录，但需要激光源进行拉制。12、清洁液：用等量的（250ml）王水（可反复应用）。一般毛坯管捆成把放入清洁液中1-2h，取出自来水冲洗20-30min，再放入无水酒精中洗涤，再放入盛满蒸馏水烧杯中加热煮沸10min，倒去蒸馏水，再换新蒸馏水反复3次，再放入烤箱中烤干，备用，切不可用市售的洗涤剂，以防降低电极充灌液的表面张力而影响冲灌。13、充灌液常用3mol/LKCl，为避免Cl-扩散，也可用2mol/L醋酸钾或柠檬酸钾充灌，也有人用0.5-1mol/LNaCl（低浓度）充灌可降低噪音。细胞外记录时，最后再用3-4mol/LNaCl+2%旁胺天蓝溶液定位。在膜片钳中还常加钙螯合剂，如EGTA。阻抗与不同组织相关。注：微电极中高浓度充灌液易蒸发，造成电极回路的开路，因此常在微电极插入Ag-AgCl丝或铂金丝后，在微电极尾部开口处涂上一层凡士林，防止水分蒸发。离体标本的灌流注，如ACSF。其中缓冲液成分有两种，一是重碳酸盐（bicarbonate）：温度低（4℃），配方有利于降低组织兴奋性。二是磷酸盐缓冲液和HEPES缓冲液：其优点是接近于人体环境。各种缓冲液一般都先配母液，临用前一天，或临用前稀释。14、电生理实验中噪声和干扰的形成和排除。（一）来源。1．干扰信号与生物电生理信号的鉴别。准确区分生物电信号与干扰的伪迹是电生理实验的先决条件。2．来源。主要有三个方面：其一。物理性干扰。1）静电和电磁的干扰：实验室附近高压电，室内日光灯可产生50Hz的静电干扰，尤其是交流电，尤其是50Hz频率干扰最大（电子设备为50Hz）。其特点是幅度大，波形规则。2）噪声干扰：电子元件本身产生杂乱无章电压和电流称噪声，一般与放大器内部元件的质量与性能有关。其二。接地不良。1）地线电阻应小。2）仪器故障。产生漏电电流，在地线上形成电位差，产生干扰。3）地线行走过程中打圈，形成线圈，易接受电场和磁场的干扰。4）各仪器设备应采用一点接地的方式，若采用多点接地，形成大地回路，也会引起干扰。5）地线过长与电源线形成交流环路。6）误用市电三孔中性线作为大地线（中性线上有4-5A电流）。其三。生理性干扰。1）大脑电活动时，眨眼、眼球运动均对脑电具有干扰作用。2）实验中环境温度过低，动物寒战、抖动，引起肌电的发放而干扰记录，或因呼吸运动引起记录部位机械位移引起干扰信号。3）心电干扰，频率与心电一致。（二）排除。1．物理性干扰。1）屏蔽法：用于低频电和静电干扰，屏蔽线分布电容较大，线与线之间不可平行排列，更不可为了美观而将多线扎在一起，这会加大分布电容，易偶合高频干扰噪声。2）远离法。3）改变位置法。依电流方向相反，产生反向磁场的原理，改变各个仪器的位置或放大器输入的方位，会使干扰磁场抵消，微电极放大器探头阻抗高，易引入干扰，实验前可反复调整其方向和位置。4）微电极记录时尽量减少微电极本身的阻抗，减少输入阻抗及干扰信号在这个阻抗上形成干扰电压降，微电极到探头的连线5cm。5）用监听器监听噪声，以便及时排除。2．仪器质量，尽量改进。3．接地不良。地线应尽量短粗，不能与电源线平行或打圈，不要接在电源线的中性线上，地线单独埋设，埋置处应较潮湿，附近无大型变压电动机，并在坑内加些食盐。4．检查各仪器是否漏电。5．慢生物电变化时用乏极化电极，实验对象宜安静，勿受振动。15、细胞内微电极记录多用幼年离体标本，其原因：1）幼年动物骨骼骨化不完全，结缔组织少，神经组织易于分离，标本耐缺氧能力强，有的标本可存活数小时至数天，但标本也可能发育不完全，如背根和脑干到脊髓的投射纤维要到三周动物才完全。神经纤维髓鞘化不全，其药理作用与成年动物也不同。从实验角度上讲，脊髓背腹根短，不利于电生理刺激记录。小鼠一般应小于15g，制备标本才有可能成功，而这样小鼠背腹根神经节不利于电生理实验。最适合的动物是金黄地鼠（hamster），介于大小鼠之间，制备标本活性很好，可能与其冬眠习性有关，而且其脊髓背腹根长达20-25mm，利于电生理记录。动物选择仍依实验而定，同一标本，不同中枢结构对缺氧耐受力也不同。金黄地鼠，若观察脊髓背角神经元活动，可用150-160g体重的鼠均可，但要研究腹角神经元，则体重不宜超过30g。16、膜片钳实验封接过程中，防震台非常重要，电极抖动主要与台子有关，而与橡皮管关系不大。橡皮管的长度与粗细和封接的难易有较大关系，应该是越近holder时，管径越细，且管子不应该太长。如果太长，给的负压就更易分散（相当于表面积大，单位负压就很小）。我们实验室用的是一种硅胶管，从老师德国带回来的，不过我见过其它实验室用一般的硅胶管做DRG细胞，也挺好的。17、我们这个软件是华中随机器送的呀。每次电压钳转成电流钳都需要面板和软件一起调，protocol的holding电压要手动调节，