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摘要：比较不同比例供肝量肝移植术后生存率和是否具有良好功能，观察Egr-1、HO-1等在小体积移植物损伤中的作用，同时进行门静脉干预，研究它对Egr-1、HO-1等表达的影响，从分子生物学水平揭示它对小体积移植物损伤的保护作用机制，以期为解决移植物大小不匹配问题提供一定的理论依据，进一步拓宽移植物的来源，使部分肝移植临床应用提高到一定高度。关键词：小体积移植物Egr-1HO-1门静脉干预报告正文(本提纲只适用于面上项目，可自行增加栏目，请撰写完毕后删除无关的信息。其他类型的项目请参照相关正文报告撰写提纲。)（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：1、项目的立项依据（附主要的参考文献目录）。供肝的短缺已成为限制肝移植进一步发展的瓶颈之一,部分肝移植(活体肝移植、劈离式肝移植)是解决供肝短缺的重要手段，已从最初的儿童肝移植扩展到成人。日本移植学会近期统计950例儿童和614例成人活体肝移植，五年生存率分别为81.5%和69.5%，移植物受体体积不匹配是成人受体预后较差的主要因素（1）。小体积移植物损伤是术后移植物功能不良的主要原因，它可能与流出道因素、门静脉血流、门静脉压力有关，但具体机制不清（2）。与全肝移植不同，由于相对大量的门静脉血流进入小移植物而产生额外损伤，这种血流动力学变化出现在再灌注后早期，是暂时性的，而肝脏微循环破坏是渐进性的，再灌注后24h出现肝窦严重的淤血和Disse腔塌陷,它在小体积移植物损伤中起重要作用（2）。小体积移植物损伤还与多种炎症介质相关，小体积移植物再灌注早期出现移植物内earlyfrowthresponse(Egr-1)、内皮素-1（ET-1）升高和(HO)-1、HSP70、抗凋亡基因A20下降。其中Egr-1起主导作用，phosphorothioateantisenseoligodeoxyribonucleotide（PAO）可直接阻断Egr-1的表达，肺移植动物实验中发现PAO可提高移植物和受体存活率（3）。PAO是否对肝脏小体积移植物损伤有保护作用及其机制，尚需进一步的研究。已有一些尝试通过调节门静脉血流来减轻小体积移植物损伤，具体方法有脾动脉结扎、脾切除、门腔分流、肠系膜上静脉腔静脉分流（4.5）。我们以前的研究也表明门静脉减压术可以降低扩大肝切除后剩余肝组织的损伤，促进再生（6）。这些干预不仅可直接调节门静脉血流动力学,还可能通过影响移植物内Egr-1、ET-1表达而改善肝脏微循环，它还可能通过调节HO-1和HSP70的表达而维持细胞内稳态，从而减轻小移植物损伤。进一步了解它对Egr-1、HO-1等炎症介质的影响，可以为门静脉腔静脉分流等门静脉干预措施提供理论依据，提高肝移植术后移植物的存活率。我们通过该模型的建立，对小移植物再灌注后血流动力学、移植物超微结构损伤作动态观察，并在分子生物学水平上对小移植物损伤机制作进一步阐述。同时进行PAO处理和门静脉血流干预，观察它们对小体积移植物损伤的保护作用及其作用机制。以期为解决移植物大小不匹配问题提供一定的理论依据，进一步拓宽移植物的来源，使部分肝移植临床应用提高到一定高度。参考文献（1）SugawaraY,MakuuchiM.Small-for-sizegraftproblemsinadult-to-adultliving-donorlivertransplantation.Transplantation.2003,75(3Suppl):S20-2.（2）ManK,FanST,LoCM,etal.Graftinjuryinrelationtograftsizeinrightlobelivedonorlivertransplantation:astudyofhepaticsinusoidalinjuryincorrelationwithportalhemodynamicsandintragraftgeneexpression.AnnSurg.2003,237(2):256-64.（3）OkadaM,FujitaT,SakaguchiT,etal.ExtinguishingEgr-1-dependentinflammatoryandthromboticcascadesafterlungtransplantation.FASEBJ.2001,15(14):2757-9.（4）SatoY,YamamotoS,OyaH,etal.Splenectomyforreductionofexcessiveportalhypertensionafteradultliving-relateddonorlivertransplantation.Hepatogastroenterology.2002Nov-Dec;49(48):1652-5.（5）TroisiR,CammuG,MiliternoG,etal.Modulationofportalgraftinflow:anecessityinadultliving-donorlivertransplantation?AnnSurg.2003Mar;237(3):429-36.（6）项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。研究内容：1.建立部分肝移植动物模型，观察不同比例供肝在移植术后的生存情况和肝功能是否良好。2.观察小体积移植物组phosphorothioateantisenseoligodeoxyribonucleotide（PAO）处理后移植物生存率和肝功能变化，并同时研究Egr-1、HO-1变化。3．门静脉置管观察小体积移植物受体门静脉干预前后门静脉血流动力学及门静脉血细胞因子（NO）水平变化。4.比较门静脉干预前后小体积移植物Egr-1、内皮素-1、HO-1、HSP70表达水平，以及凋亡基因（Fas/FasL）、Bax和抗凋亡基因A20的表达，同时通过TUNEL免疫组化检测观察被着色的凋亡细胞。5.通过电镜观察小体积移植物术后的再生情况。研究目标：1.我们通过该模型的建立，对小移植物再灌注后血流动力学、移植物超微结构损伤作动态观察，并在分子生物学水平上对小移植物损伤机制作进一步阐述。2.观察phosphorothioateantisenseoligodeoxyribonucleotide（PAO）对小体积移植物损伤的保护作用，研究其可能的作用机制。3.同时进行门静脉血流干预，观察它对小体积移植物损伤的保护作用及其作用机制。4.同时观察小体积移植物术后再生过程及相关影响因素，以期为解决移植物大小不匹配问题提供一定的理论依据，进一步拓宽移植物的来源，使部分肝移植临床应用提高到一定高度。拟解决的关键问题：1.不同比例肝移植对部分肝移植疗效的影响。2.通过门静脉腔静脉分流进行门静脉干预，门静脉系统置管了解门静脉血流动力学变化，确定合适分流口径。3.通过上述phosphorothioateantisenseoligodeoxyribonucleotide（PAO）处理和门静脉干预前后Egr-1、HO-1、HSP70的表达水平变化。2、拟采取的研究方案及可行性分析。研究方案1建立不同比例供肝肝移植大动物模型，分别为30%，60%，100%比例供肝。2小体积（30%比例）移植物组进行phosphorothioateantisenseoligodeoxyribonucleotide（PAO）处理。3通过门静脉腔静脉分流进行门静脉干预，建立稳定的门静脉干预组动物模型，同时门静脉系统置管了解血流动力学变化，根据门静脉压力确定合适的分流口径。4RT-PCR、western-blott方法研究phosphorothioateantisenseoligodeoxyribonucleotide（PAO）处理和门静脉干预前后移植物Egr-1、HO-1、HSP70、ET-1表达的变化。5观察干预前后凋亡基因（Fas/FasL）、Bax和抗凋亡基因A20的表达，同时通过TUNEL免疫组化检测观察被着色的凋亡细胞。技术路线：%指供肝重量/受体肝脏重量猪72头随机分组100%组(4对)60%组(8对)30%组(8对)30%组+PAO处理（8对）30%组+门静脉干预（8对）比较生存率肝功能*ALTASTSEC凋亡肝星状细胞活性的观察凋亡基因Fas/FasL、Bax等表达抗凋亡基因A20表达TUNEL免疫组化*检测时相：术前、术后即刻、30min、2hrs、6hrs、12hrs、24hrs、2d、3d、4d和5d移植肝再生动态观察HSP表达Egr-1、HO-1、ET-1表达可行性分析：（1）本课题是在一定预实验基础上开展的，目前课题已掌握大动物活体肝移植模型的建立特别是30%比例，其生存率达到50%。（2）已研究大鼠缺血再灌注损伤机制多年，初步积累了相关检测项目的方法。（3）近年来进行门静脉减压术在扩大肝切除中的研究，还进行活体肝移植极限供肝量的动物模型的大动物实验研究，为我们开展该研究增强了信心。最近我们与匹兹堡大学医学院starzl器官移植中心合作，进行了不同比例供肝的大动物肝移植研究，初步发现Egr-1在小体积移植物损伤中起主要作用。（4）课题组长期从事小动物的缺血再灌注损伤、供体的冷保存损伤、肝脏的缺血预处理到活体肝移植极限供肝量的实验研究，具有承担并成功完成课题的能力，课题将在国家人类基因南方中心进行，课题组将充分利用国家人类基因组南方中心的研究基地，这为该课题实施和完成提供人力和物力保障。本项目的特色与创新之处。1).建立稳定的不同比例肝移植大动物模型。2).研究小体积（30%）移植物损伤的分子生物学机制对扩大供肝来源具有重要意义，同时利用药物处理和手术门静脉干预，研究Egr-1、HO-1、HSP70等炎症介质的表达变化，国内外尚无相关报道。3）动态观察小体积移植物门静脉干预前后的再生过程。3、年度研究计划及预期研究结果。年度研究计划——在掌握活体肝移植动物模型的基础上进一步熟练手术操作技术，购买相应的试剂，购买相应器械。与我院国家人类基因重点实验室联系，由该实验室合成Egr-1、HO-1、HSP70等的引物。——完成全肝移植和60%、30%比例肝移植动物实验。——完成30%组+PAO处理、30%组+门静脉干预动物实验。——完成标本的检测，包括处理前后、干预前后Egr-1、HO-1、HSP70等表达变化，同时观察移植肝再生过程、SEC细胞凋亡、Kupffer细胞的变化。——完成相关资料的总结并完成鉴定。预期研究成果1).猪小体积肝移植动物模型达到国际先进水平。2).阐明PAO对小体积移植物损伤的保护作用及其机制。3).阐明门静脉干预对小体积移植物损伤的保护作用及其机制，为其在小体积肝移植中的应用提供理论依据。进一步扩在供肝的来源。4).进一步研究小体积移植物损伤的分子生物学机制，小体积移植物损伤除与血流动力学相关外，还与移植物内Egr-1、HO-1、HSP70的表达变化相关，这些干预不仅能改善门静脉血流动力学，还通过调节上述因子的表达而减轻小体积移植物的损伤。这些干预措施还可以促进移植肝的再生。5）在国内外发表有质量论文2-3篇，能有1篇被SCI收录。（二）研究基础与工作条件1、工作基础1.与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩1)瑞金医院门静脉高压、器官移植组从事门静脉高压的发病机制、小动物的缺血再灌注损伤、供体的冷保存损伤、肝脏的缺血预处理到活体肝移植极限供肝量的实验研究，有近20年的研究基础。近年来进行门静脉减压术在扩大肝切除中的研究，发现它能降低剩余肝组织的损伤，促进再生，PVP在其中起重要作用。我们还进行活体肝移植极限供肝量的动物模型的大动物实验研究，并取得了较高的存活率，从目前的实验结果表明30%比例的供肝组仍有50%的生存率，为我们开展该研究增强了信心。最近我们与匹兹堡大学医学院starzl器官移植中心合作，进行了不同比例供肝的大动物肝移植研究，初步发现Egr-1在小体积移植物损伤中起主要作用，我们希望能进一步研究门静脉干预对Egr-1表达的影响。课题承担学科是“211”重点学