细胞工程

第三章细胞工程学习目的：①了解原生质体的制备、培养及细胞融合的基本原理、方法与技术。②学习如何进行动植物组织培养原理、方法与技术。③认识单倍体植物的诱发及人工种子制备的基本要领。④掌握利用动物体细胞克隆哺乳动物的基本做法及其重要意义。⑤领会体细胞研究的原理和光明前景。学时数：6学时主要内容：3.1细胞工程的基础知识与基本技术3.3动物细胞工程基础知识细胞组织培养基本操作动物细胞融合3.2植物细胞工程淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术植物组织培养细胞核移植与动物克隆植物细胞培养和次生代谢物的生产染色体转移及干细胞研究植物细胞原生质体制备与融合3.4微生物细胞工程单倍体植物的诱发与利用原核细胞的原生质体融合人工种子的研制真菌的原生质体融合细胞工程：细胞工程是指在细胞水平上进行的遗传操作，即研究、开发、利用各类细胞的工程。人们通过科学设计与精细操作，改变细胞的遗传基础，并通过无菌操作，大量培养细胞，使其再生成细胞、组织、器官乃至完整有机体，或生产出目物质的技术。迄今为止，人们已经从染色体水平、细胞器水平以及细胞水平开展了多层次的大量工作，在细胞培养、细胞融合、细胞代谢物的生产和生物克隆等诸多领域取得了令人瞩目的成果。细胞工程的分类：根据研究操作的对象不同，细胞工程又可分为三类，即植物细胞工程；动物细胞工程；微生物细胞工程。第一节细胞工程的基础知识与基本技术一、细胞工程的基础知识细胞是细胞工程操作的主要对象。生物界有两大类细胞：原核细胞与真核细胞。原核细胞细菌、放线菌等的细胞属于原核细胞。原核细胞体积较小，DNA环状、不与蛋白质结合而裸露于细胞质中。胞内无膜系构造的细胞器。胞外由肽聚糖组成细胞壁，是细胞融合的主要障碍。原核细胞生长迅速，无蛋白质结合的DNA，易于人工遗传操作，是细胞改造的1良好材料。真核细胞酵母、动物、植物等的细胞属于真核细胞。真核细胞体积较大、内有细胞核和众多膜系构造的细胞器。植物细胞有以纤维素和半纤维素为主要成分的细胞壁。真菌细胞壁主要由各种葡聚糖构成网状纤维物，还有甘露聚糖、蛋白质和脂质填充其中。真核细胞一般都有明显的细胞周期，处于有丝分裂时期的染色体呈现高螺旋紧缩状态，既不利于基因外钓，也难于插入外源基因。诱导真核细胞同步化生长，对于成功地进行细胞融合及细胞代谢物的生产具有重要作用。二、基本实验操作技术（一）无菌操作技术细胞工程的实验操作需要在无菌条件下进行，稍有疏忽都可能引致污染，导致实验失败。无菌室要定期用紫外线或化学试剂消毒，实验前后还应各消毒一次。无菌室外有间缓冲室，实验人员在此换鞋、更衣、戴帽，做好准备后方可进入无菌室。应注意周围环境的卫生整洁。超净工作台是昀基本的实验设备，能满足较高的无菌要求。对生物材料要进行彻底消毒与除菌，实验所用器械、器皿和药品都应进行灭菌或除菌。（二）细胞培养技术细胞培养是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。不同细胞的培养条件差异较大，但细胞培养过程有共同之处：①取材和除菌。除了淋巴细胞可直接抽取以外，植物材料在取材后，动物材料在取材前都要用一定的化学试剂进行严格的表面清洗、消毒。有时还需借助某些特定的酶，对材料进行预处理，以期得到分散生长的细胞。②培养基的配制。根据各类细胞的特点，配制细胞培养基，对培养基进行灭菌或除菌。③接种与培养。采用无菌操作技术，将生物材料接种于培养基中，置于培养室或培养箱中，提供细胞生长所需的昀佳培养条件，如温度、湿度、光照、氧气及二氧化碳等。当细胞达到一定生物量时应及时收获或传代。（三）细胞融合技术两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。细胞融合的主要过程：①制备原生质体由于微生物及植物细胞具有坚硬的细胞壁，因此通常需用酶将其壁降解。动物细胞则无此障碍。②诱导细胞融合两亲本细胞(原生质体)的悬浮液调至一定细胞密度，按适当比例混合后，逐渐滴人高浓度的聚乙二醇(PEC)等诱导融合，或用电激的方法促进融合。③筛选杂合细胞将上述混合液移到特定的筛选培养基上，让目的杂合细胞生长，其他细胞无法生长。藉此获得具有双亲遗传特性的杂合细胞。第二节植物细胞工程2一、植物组织培养（一）植物组织培养的历史植物组织培养是在离体人工调控的条件下，培养、研究植物细胞、组织、器官，进而分化、发育形成完整植株的技术。20世纪初，德国植物学家Haberlandt就曾预言“植物细胞具全能性”。但由于技术上的限制，离体培养细胞未能分裂。不久之后，Hanning成功地培育出能正常发育的萝卜和辣根菜的胚，成为植物组织培养的鼻祖。20世纪30年代，植物组织培养取得了长足的进展。我国植物生理学创始人之一李继侗、罗宗洛和罗士伟相继发现银杏胚乳和幼嫩桑叶的提取液能分别促进离体银杏胚和玉米根的生长，据此证明维生素和其他有机物是培养基中不可缺少的重要组成成分。1934年美国人White以西红柿根为材料，建立了第一个能无限生长的植物组织组培物。1956年Miller发现了激动素，并指出激动素能强有力地诱导组织培养中的愈伤组织分化出幼芽。这是植物组织培养中的一项重要进展。1958年Steward顺利地从胡萝卜的细胞培养中分化长出了胚状体乃至整株。从此以后，通过组织培养方法培育完整植株的探索便在世界范围内蓬勃开展。现在已有600多种植物能够借助组织培养的手段进行快速繁殖，多种具有重要经济价值的粮食作物、蔬菜、花卉、果树、药用植物等实现了大规模的工业化、商品化生产。我国的植物组织培养工作起步较迟，但已经在多个方面取得了巨大成绩。（二）植物组织培养的过程植物组织培养一般要经历以下五个阶段：预备阶段→诱导去分化阶段→继代增殖阶段→生根发芽阶段→移栽成活阶段。1、预备阶段(1)选择合适的外植体外植体是指能被诱导产生无性增殖系的器官或组织切段，如一个芽，一段茎。选择外植体一般以幼嫩的组织或器官为宜，外植体的选择、外植体的去分化及再分化的昀适条件都需进行摸索，他人成功的经验可供借鉴，并无快捷方式可循。就外植体而言，具体来说要综合考虑以下几方面因素：①大小适宜，外植体的组织块要达到2万个细胞(即5-10mg)以上才容易成活。②同一植物不同部位的外植体的分化能力、分化条件及分化类型有相当大的差别。③植物胚与幼龄组织、器官比老化组织、器官更容易去分化，产生大量愈伤组织。愈伤组织原意指植物因受创伤而在伤口附近产生的薄壁组织，现已泛指细胞与组织培养产生的可传代的未分化细胞团。④不同物种相同部位的外植体细胞分化能力可能大不一样。(2)除去病原菌及杂菌选择外观健康的外植体，尽可能除净外植体表面的各种微生物是成功进行植物组织培养的前提。消毒剂的选择和处理时间的长短与外植体对所用试剂的敏感性密切相关(表3—1)。通常幼嫩材料处理时间比成熟材料要短些。对外植体除菌的一般程序如下：外植体→自来水多次漂洗→消毒剂处理→无菌水反复冲3洗→无菌滤纸吸干。(3)配制适宜的培养基虽然由于物种的不同，外植体的差异，组织培养的培养基多种多样，但它们通常都包括以下三大类组分：①含量丰富的基本成分，如蔗糖或葡萄糖高达每升30g，以及氮、磷、钾、镁等；②微量无机物，如铁、锰、硼酸等；③微量有机物，如吲哚乙酸、激动素、肌醇等。各培养基中，吲哚乙酸和激动素的变动幅度很大，这主要因培养目的而异。一般较高的生长素(吲哚乙酸)对细胞分裂素(激动素)比值有利于诱导外植体产生愈伤组织，反之则促进胚芽和胚根的分化。2、诱导去分化阶段组织培养的第一步就是让外植体去分化，使各细胞重新处于旺盛有丝分裂的分生状态，培养基中一般应添加较高浓度的生长素类激素。去分化阶段为植物细胞依赖培养基中的有机物等进行的异养生长，原则上无需光照。但通常还是置于人工照明条件下培养，以期得到绿色愈伤组织。去分化可以采用固体培养基(在培养基中添加琼脂0.8％～1.0％)或液体培养基。固体培养简便易行、占地面积小、可在培养室中多层培养。但外植体营养吸收不均、气体及有害物质排换不畅，愈伤组织易出现极化现象。液体培养中，培养材料营养吸收及与环境的物质交换便捷，但需提供振荡设备，投资较大，且一旦染菌则难以挽回。3、继代增殖阶段愈伤组织长出后经过4—6周的迅速细胞分裂与增殖，原有培养基中的水分及营养成分多已耗失，细胞的有害代谢物已在培养基中积累，因此必须进行移植，即继代增殖。同时，通过移植，愈伤组织的细胞数大大扩增，有利于下阶段收获更多的胚状体或小苗。4、生根发芽阶段愈伤组织只有经过再分化才能形成胚状体，继而长成小植株。胚状体是指在组织培养中分化产生的具有芽端和根端类似合子胚的构造。将愈伤组织移置于含适量细胞分裂素，没有或仅有少量生长素的分化培养基中，诱导胚状体的生成。光照是必备的外部因子。根据实验需要，有时可不经愈伤组织阶段而直接诱4导外植体分生、分化长成一定数量的丛生芽，然后再诱导其生成根。5、移栽成活阶段生长于人工照明玻璃瓶中的小苗，要适时移栽到室外以利生长。此时的小苗十分幼嫩，移植应在能保证适度的光、温、湿条件下进行。在人工气候室中锻炼一段时间(称为炼苗)能大大提高幼苗的成活率。二、植物细胞培养和次生代谢物的生产◆植物细胞次生代谢物质来源丰富植物细胞在生理生化过程中会产生数量极为可观的次生代谢物质。目前已发现的植物天然代谢物已超过2万种，而且还在以每年新发现1600种的速度递增。我们祖先在与疾病的抗争中已积累了丰富的利用植物中的生物活性物质治病强身的经验。李时珍(1593)编篆的巨著《本草纲目》中所开列的1892种药物绝大多数是植物。目前约25％的法定药品来自植物。然而植物生长缓慢，自然灾害频繁。即使是大规模人工栽培仍然不能从根本上满足人类对经济植物日益增长的需求。◆代谢物质1956年，Routier和Nickell提出工业化培养植物细胞以获得其天然产物的大胆设想。1968年，Reinhard等首先将这种设想转变成现实，生产出了哈尔碱(hflfmine)。1969年，Kaul等培养植物细胞获取了其中的薯蓣皂苷。1972年，Fumya等培养植物细胞获取了其中的人参皂角苷。1973年，Teuscher等培养植物细胞获取了其中的维斯纳精(visnagin)。◆研发形势现在一些发达国家已集中相当数量的人力、财力潜心开拓这个经济潜力十分巨大的生产领域。目前世界上昀大批量工业化培养细胞(烟草细胞)已达2万升。我国在“八五”、“九五”和863计划”中连续拨款资助工业化培养红豆杉细胞生产抗肿瘤药物紫杉醇的研究，目前得率已达到60mg／L的世界先进水平。工业化植物细胞培养系统主要有两大类：悬浮细胞培养系统和固定化细胞培养系统。前者适于大量快速地增殖细胞，但往往不利于次生代谢物的积累；后者则相反，细胞生长缓慢而次生代谢物含量相对较高。（一）悬浮细胞培养系统1953年Muir成功地对烟草和直立万寿菊的愈伤组织进行了悬浮培养。以后Tulecke和NickeH(1959)推出了一个20L的植物细胞封闭式悬浮培养系统(图3—1)。该系统由培养罐及5四根导管连通辅助设备构成，经蒸汽灭菌后接人目的培养物，以无菌压缩空气进行搅拌。当营养耗尽，细胞数目不再增加且次生代谢物达一定浓度时，收获细胞，提取产物。他们用此系统成功地培养了银杏、冬青、黑麦草和蔷薇等细胞。本系统的突出优点是结构简单，易于操作。但它的生产效率不够高，次生代谢物累积的量也较少。后人在此基础上进行了改进，包括：①半连续培养方法，即每隔一定时间(如1-2天)收获部分培养物，再加入等量培养基的方法；②连续培养方法，即培养若干天后在连续收获细胞的同时不断补充培养液的方法。这两个系统较明显地提高了细胞的生产率，但由于收获的是快速生长的细胞，其中的次生代谢物含量依然很低。看来有必要控制不同的参数分阶段培养细胞。如前阶段营养充足，加大通气，促进细胞大量生长；后阶段由于营养短缺、溶解氧供应不足导致细胞代谢途径改变，转而累积较高浓度的次生代谢物质。（二）固定化细胞培养系统针对上述细胞悬浮培养的缺点，Brodelius(1979)等人首次报道用藻酸钙成功地固定化培养了桔叶鸡眼藤、长春花、希腊毛地黄细胞。实