细胞工程2基本技术

细胞工程CELLENGINEERING第二章实验室及实验基本技术一实验室设置二基本技术三培养条件控制一.实验室设置※实验室组成※基本设备配置※培养容器与用具1、实验室组成实验准备—包括培养基配制，洗涤与灭菌等无菌操作控制培养CultureroomPreparationroomSterili-zingroomSterileoperationCytologyroomTransi-tionarea实验室布局示意图基本实验室准备室准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。接种室接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。辅助实验室细胞学实验室其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。理化分析室在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。摄影室及暗室其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。2、基本设备配置常规设备灭菌设备培养设备无菌操作设备其它设备常规设备酸度计电子天平纯水器大容量高压灭菌器全自动手提式灭菌器电热干燥箱灭菌设备Zeiss滤器超净工作台无菌操作设备培养设备高效培养架细胞学研究设备流式细胞仪3、培养容器与用具二.基本技术※洗涤※灭菌※培养基※接种1、洗涤合成洗涤剂铬酸洗涤液常用的铬酸洗涤液配方成分强酸溶液中酸溶液弱酸溶液重铬酸钾(g)63120100硫酸(ml)1000200100蒸馏水(ml)2002001000注意事项在蒸馏水中缓慢加入浓硫酸，加热的同时分次加入磨碎的重铬酸钾至其完全融解。重铬酸钾加蒸馏水后加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸。玻璃器皿洗涤新购置的需稀酸浸泡过夜，洗衣粉刷洗，清水冲洗；用过的洗衣粉刷洗，清水冲洗后备用塑料用品洗涤新购置的即用；用过的冲洗干净后稀碱浸泡过夜，清水冲洗，稀酸浸泡30min，清水冲洗后备用。金属用品洗涤金属用品一般不宜用洗涤液洗涤，需要清洗时一般用酒精擦洗，然后火焰干燥。培养基湿热灭菌，即高压蒸汽灭菌或过滤灭菌。玻璃器皿湿热灭菌或干热灭菌，即在烘箱中加热至160℃～180℃40min，或120℃2h。金属用具干热灭菌或浸泡于70﹪酒精后火焰灼烧。操作环境接种室常采用定期熏蒸，熏蒸剂常采用甲醛加高锰酸钾，一般每100ml甲醛加5g高锰酸钾。2、灭菌培养基体积与灭菌时间的关系培养基体积（ml）灭菌温度（℃）灭菌时间（min.）20～501212050～50012125500～5000125353、培养基组成及配制事实上，培养基的研制始终伴随着组培技术的发展，整个组培的发展史就是一部培养基的研制史：1902Haberlandtknop培养液＋Suc失败1939White等人无机＋有机（VB）＋IAA脱分化1957Skoog&MillerCYT/IAA激素调控再分化1958Steward首次实现植株再生里程碑培养基的名称，一直根据沿用的习惯。多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基(简称MS培养基)，也有对某些成分进行改良，称作改良培养基。培养基基本成分培养基配方培养基配制复合配方培养基基本成分水无机盐有机成分激素其它大量元素微量元素基本培养基＝无机＋有机常用的基本培养基有：White、MS、B5、N6等。培养基基本成分水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。无机盐类大量元素大量元素使用量一般每升几十至几千毫克。大量元素包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。微量元素微量元素的用量一般低于10-5～10-7mol/L。植物所需微量元素有Fe、Cu、Zn、B、Mo、Mn、Co。有机成分糖维生素肌醇腺嘌呤氨基酸其它复合成分OCH2OHHHHOHOHOHHHOHOCH2OHHHHHOCH2OHOa-1，2-苷键或b-2，1-苷键α-D-葡萄糖β-D-果糖蔗糖生物素即维生素H，它是多种羧化酶的辅酶。在生物合成中起传递和固定CO2的作用。HNNHCOCHH2CS(CH2)4COOH肌醇又称环己六醇，广泛分布在动物和植物体内。最早从心肌和肝脏中分离得到。环己六醇在自然界存在有多个顺反异构体，但有价值的、天然存在的异构体为顺-1，2，3，5-反-4，6-环己六醇即肌肉肌醇，结构式如右，是磷脂的一种－磷脂酰肌醇的组成成分。在糖类的相互转化、维生素和激素的利用等方面具有重要的促进作用。myo-inositol腺嘌呤的作用首先是skoog和Tsui于1948年发现的，他们在实验室中观察到，使用腺嘌呤能够刺激烟草茎段不定芽的发生。以后的研究表明，腺嘌呤是合成各种细胞分裂素的前体物质之一。外源添加酰嘌呤具有促进细胞自身合成细胞分裂素的功能，有利于细胞的分裂和分化，促进芽的形成和生长。氨基酸是蛋白质组成成分。常用氨基酸为甘氨酸及多种氨基酸的混合物，如水解酪蛋白，水解乳蛋白等。天然复合物：大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用。由于成分复杂，实验可重复性差，应尽量不用或少用。但有时大胆启用此类物质可能起到意想不到的效果。常用的有：CH（水解酪蛋白）、CM（椰子汁）、ME（麦芽浸提物）、YE（酵母浸提物）、TJ（番茄汁）、香蕉、马铃薯等。植物激素生长素细胞分裂素其它植物激素，是植物新陈代谢中产生的天然化合物，能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物生长调节物是关键物质，对植物组织培养起着决定性作用，它的运用也是植物细胞工程研究的重要的基本方法。生长素类(auxin)吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)细胞分裂素类(ctytokinin)激动素(KT)、6-苄基嘌呤(6-BA)、异戊烯腺嘌呤(2-ip)、玉米素(ZT)赤霉素类(gibberellins)GA3脱落酸(abscisic)乙烯(ethylene）Auxin体内可增强RNA和蛋白质的合成，促进细胞伸长和分裂，使保持顶端优势，刺激生根等；体外促进离体细胞分裂形成愈伤组织，或者是诱导试管苗生根；IAA见光易分解，IBA、NAA和2,4-D稳定，是组培中常用的生长素；不同的生长素生理活性的强度不同，IAA、NAA和2,4-D的强度比约为1：10：100Ctytokinin体内可促进细胞分裂和器官分化，终止种子和芽的休眠，打破顶端优势等；体外诱导离体培养的芽形成丛生芽，诱导离体组织的细胞的增殖并再生不定芽；与生长素合用有增效作用，按不同的比例配合可产生不同的效果赤霉素存在于从真菌到高等植物中的化合物，共20余种，其中GA3为组培中常用；体内主要功能为促进细胞的伸展和茎叶的伸长等；组培中主要用于诱导离体芽的萌动和伸长乙烯是植物正常代谢的一种产物，微量即可引起植物体的许多反应；体内主要功能为加速果实的成熟和组织的老化；对组织培养物的生长、胚胎发生或芽的形成产生抑制作用，应设法抑制培养物产生乙烯脱落酸发现于研究桦树芽的休眠和棉花脱叶中；体内主要功能广泛，包括启动种胚发育后期的脱水过程，促使芽和种子进入休眠状态等；组培中很少使用，一般只在胚胎发育和胚状体诱导实验中应用，可抑制胚胎的过早萌发IAA→由顶端分泌，诱导细胞分裂，促进生根①常用种类：IAA、IBA、NAA、2,4-D等使用效价：IAAIBANAA2,4-DNAA、IBA→生根培养2,4-D→愈伤组织诱导与增殖②用量：mg/L级，mg/L=ppm③用法：溶于95％乙醇或0.1mol/LNaOHCYT→由根尖分泌，促进细胞分裂、促生芽①常用种类：KT、6-BA、2-ip、ZT等使用效价：KT6-BA2-ipZT②用量：mg/L级③用法：溶于0.5mol/L稀HCl或稀NaOH，通常多用NaOH助溶。★CYT＋IAA的结合是实现器官发生很好的配合式!激素配比模式生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，即长愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素浓度，或调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。高有利于根的形成和愈伤组织形成生长素/细胞分裂素适中有利于根芽的分化低有利于芽的形成生长调节物质的使用甚微，一般为mg／L级。在组织培养中生长调节物质的使用浓度会因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异，一般生长素浓度的使用为0.05~5mg／L，细胞分裂素0.05~10mg／L。其它附加成分琼脂活性炭培养基营养成分对非洲紫罗兰组织培养的影响GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsNosucrose(0%)Sucrosereducedto1%Sucroseincreasedto5%Theexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfaceVeryfewshootshavedevelopedontheexplant.Norootsandnocallus.Shootsdevelopedonedgesofuppersurface,andsomerootdevelopmenthasoccuredShootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.TheresultiscomparablewiththecontrolmediumtissuecultureintheAfricanVioletNoBAPBAPreducedto0.1mg.l-1NoNAAPoorshootdevelopmentandnoroots.ExtensivecallusgenerationPoorshootdevelopmentandnorootsNAAreducedto0.1mg.l-1Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.UndifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantNAAincreasedto5.0mg.l-1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.SomecallusNoMSsaltsNosignofregenerationfromexplantatall.MSsaltsreducedto0.47g.l-1SomerootgrowthbutreduceddevelopmentofshootsMSsaltsincreasedto9.52g.l-1Shootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus.常用培养基配方常用培养基配方：White(White,1934)MS(MurashingandSkoog,1962)B5(Gamboretal,1968)N6(朱至清，1974)母液(stocksolution)的配制和保存:母液（贮备液）：根据实验需要将试剂分类按一定浓度比例配制成的浓缩液。目的：简化操作、保证精度、方便冷