细胞工程之核移植技术与动物克隆

第八章核移植技术与动物克隆1Wilmutetal.1997,Science（1996.6诞生）2什么是克隆**？克隆(Clone)***有两个方面的含义：一是指用无性方式进行无性繁殖的技术。二是指经过无性方式繁殖所得到的后代群体。J.B.S.Haldane，1963，“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克隆(Clone)”的术语。Clone起源于希腊文“Klone”，原意是用“嫩枝”或“插条”繁殖。3什么是克隆**？克隆的生物范畴分子克隆：如基因克隆细胞克隆：如杂交瘤细胞克隆动物克隆：包括核移植技术（核心）卵裂球培养胚胎分割技术4什么是动物克隆？动物克隆是一种通过核移植过程进行无性繁殖的技术。基本手段或步骤：1.获得“供体细胞的细胞核”：早期胚胎细胞、成年体细胞2.获得无核卵母细胞。3.将目标细胞核经显微手术移植到去核卵母细胞中4.适当的条件下，移植卵母细胞重新发育成正常胚胎。5.胚胎被移植到适当母体中，获得与供核个体遗传性状已知的个体。5第1节核移植技术6核移植技术就是利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而可能创造无性杂交生物(新品种)的一项技术。一、核移植技术***（Nucleartransfer）概念：71.核移植技术的类型一、核移植技术（Nucleartransfer）胚胎细胞核移植干细胞核移植体细胞核移植类型81.核移植技术的类型1.1b胚胎干细胞核移植优点：91.1a胚胎细胞核移植优点：分化程度低分化潜能大核移植容易成功具有胚胎细胞上述优点体外培养寿命长，培养更方便1.2体细胞核移植特点：1.核移植技术的类型10核供体为成体体细胞范例：克隆绵羊“多莉”体细胞核全能性的恢复1.2体细胞核移植----克隆绵羊“多莉”1.核移植技术的类型111.2体细胞核移植----“多莉”的意义1.核移植技术的类型促进生物学和医药学的研究获得更多的优秀动物个体可以复制生产高价药物的动物12为何是突破性的工作：解决了使供体细胞与核受体细胞(去核卵细胞)同步的方法。解决了用体细胞做核供体与转基因的问题。13克隆羊多莉的重要生物学意义***：第一，它证明了：14一个已经完全分化了的动物体细胞核仍然保持着当初胚胎细胞的全部遗传信息分化了的体细胞具有再分化的全能性（可恢复发育过程中失去的全能性）遗传物质是可逆变化的第二，多莉的成功提示：15在培育体细胞成为核供体之前，利用“基因靶”技术精确地植入外源目的基因，诱发核基因的遗传改变再用选择技术准确地挑选那些含目的基因的细胞作为核供体，从而生产出基因克隆体。第三，多莉羊的诞生标记：人类可以对基因进行有规律地控制而解决更多的问题利用克隆技术复制哺乳类动物的最后技术障碍已被突破，在理论上已成为可能。161.2体细胞核移植----“多莉”的后续影响1.核移植技术的类型产生克隆人的伦理问题促进克隆技术的变革2002年，时年6岁的多莉因“老龄性”肺部感染而安乐死，再次引发克隆动物是否“早衰”的争论172.哺乳动物核移植技术的主要操作程序****(1)核受体的处理和制备18(3)细胞核移植(2)核供体的处理和制备(4)重组核的激活(6)核移植胚胎移入代孕母畜（即胚胎移植）(5)重组胚的体外或体内培养克隆羊多莉产生的技术流程19核受体细胞选择：去核卵母细胞常常作为核移植的受体细胞。选择的生物学依据(或为何选择卵细胞为核移植受体细胞)：(1)核受体细胞的准备20在卵母细胞的细胞质含有某种特定的因子，可以使移植核中所含有的基因表达程序发生重新排列。使已经分化了的细胞重新回到发育过程的原点，同受精卵一样开始个体发育过程。卵母细胞的来源：用激素对雌体进行超排处理，从输卵管冲出体内成熟的MII卵母细胞。从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)，在体外培养成熟后作为受体。冷冻保存的卵母细胞(1)核受体细胞的准备21卵母细胞的去核处理：(1)核受体细胞的准备22将MII卵母细胞置于含细胞松弛素(5-7.5ug/mL)的培养液处理10-20min.显微镜下以持卵管吸住卵母细胞.以尖端去核针刺穿透明带，吸出第一极体和极体下1/3胞质.供体细胞核具备的条件：必须是完整的二倍体，保持有供体动物完整的基因组供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下，产生细胞分化过程的逆转，能重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程。(2)核供体细胞的准备23供体细胞类型：胚胎卵裂球细胞体细胞胚胎干细胞和胎儿成纤维细胞(2)核供体细胞的准备24(3)细胞核移植胞质内注射透明带下注射25胞质内注射是用一个外径5～8μm的注核针吸取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中，核移植后用电刺激进行细胞融合固定针对准极体部位，将卵母细胞固定，去核微吸管对准极体插入透明带，将极体和部分细胞质吸入吸管中26吸管拉出时，细胞膜被拉长形成一个桥，吸管脱离透明带，质膜被掐断，挤推出管中的极体和细胞质27体外受精卵形成的8细胞牛胚胎经透明质酸处理后，分离出8枚分裂球，吸取细胞核28将胚胎细胞的细胞核移入去核卵母细胞的透明带中29(4)激活受精引起的卵母细胞激活人工的激活激活是胚胎发育所必需的人工激活:30是通过电刺激、钙离子载体等方法，使卵母细胞从MII期中解放出来，并转到“受精”的状态瞬时直流电脉冲激活化学试剂激活：Ca2+载体、乙醇、SrCl2、放线菌酮、离子霉素人工激活的手段:(5)重组胚的体内或体外培养核移植胚的体内培养：一般植入输卵管4-7d，发育到桑椹胚或囊胚，如牛、羊、猪核移植胚的体外培养：体外培养基培养，发育到桑椹胚或囊胚，如大鼠、小鼠、兔31(6)胚胎移植受体母畜的选择：皮毛颜色与供体品种不同、繁殖性能强、体格稍大的当地品种移植部位：输卵管、子宫角移植方法：同期发情处理常规法移植32第2节核移植技术的应用33二、核移植技术的应用1．制备转基因克隆动物，进行生物药物生产2．培育优良畜种，扩大良种种群3．开展异种动物克隆，拯救濒危动物转基因克隆山羊生产：抗凝血因子III转基因克隆羊、牛生产：a-1-抗胰蛋白酶转基因克隆牛生产：胶原蛋白转基因克隆猪生产：人生长激素培育品系更纯的实验动物培养优质畜种培育种间杂交动物，用于育种用兔卵母细胞获得大熊猫早期胚胎34二、核移植技术的应用4．与干细胞技术结合，开展治疗性克隆治疗性克隆***(Therapeuticcloning)利用核移植技术与转基因和胚胎干细胞等生物技术结合，体外培养所需细胞、组织器官、以替代或修补患者损伤或患病的细胞、组织、器官的过程运用举例：患者体细胞去核人卵母细胞重组胚囊胚ES细胞定向分化多巴胺神经元帕金森病胰岛细胞糖尿病肝细胞肝纤维化CD4+T细胞艾滋病35二、核移植技术的应用5．利用核移植技术，研究生物学的基本问题细胞分化基因调控核质关系基因组印记36克隆技术存在的问题理论问题分化的体细胞克隆对遗传物质重编程的机理还不清楚细胞核内关闭的基因如何重启表达细胞如何重新恢复全能性及过程克隆动物的连续后代是否会累积突变基因克隆动物是否会记住供体细胞的年龄克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题不清楚37实践问题克隆动物的成功率还很低生出的部分个体表现出生理或免疫缺限可能出现早衰迹象核移植技术环节尚不完善克隆技术存在的问题38社会伦理问题克隆技术（尤其是在人胚胎方面的应用）对伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用克隆技术存在的问题39重要概念：思考题39问题：Clone:P3核移植:P7克隆的主要类型:P4核移植的主要类型:P8胚胎细胞与体细胞核移植各有何特点:P9-10多莉的诞生证明什么重大生物学问题:P14哺乳动物核移植的主要操作流程:P18，此外结合P20,P24,P25，P30，P31，P32,注意细节核移植的主要应用(框架式)，并举1-2例:P34-36兴趣题：思考题39结合细胞分化，查资料阅读或设计课题或实验研究核移植时遗传物质重编程