色谱分析检测技术GC.

胡蒋宁色谱的基本概念气相色谱提纲液相色谱1.色谱法概述重现1903年俄罗斯植物学家Tsweet茨维特植物提取液CaCO3玻璃柱石油醚淋洗色谱色：颜色谱：图谱1906年茨维特论文发表创建石油醚流动相石油醚固定相CaCO3两相本质：混合物分离色谱法分离过程色谱分离法的原理？？？迁移固定液载气ts1941Martin和Synge提出液-液色谱理论；1952James和Martin发展了气相色谱；1956VanDeemter提出速率理论；1967Kirkland等研制高效液相色谱法；2.分类按流动相分气相色谱（GC）液相色谱（LC）超临界流体色谱（SFC）按机理分吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱按固定相在支持体中的形状分柱层析色谱平板色谱纸色谱薄层色谱按分离效率分经典液相色谱高效液相色谱最新进展微柱色谱毛细管电动色谱色谱流出曲线示意图WbW1/21/2h0.607h3.基本概念与术语1、色谱流出曲线（chromatogram）指样品注入色谱柱后，信号随时间变化的曲线。2、常用术语（1）基线无组分通过色谱柱时，检测器的噪音随时间变化的曲线。（2）峰宽峰底宽Wb峰半宽W1/2标准偏差4bW2ln2221W色谱参数示意图1/2h0.607hW1/2WbtRt0（3）保留值保留时间tR——进样到出现色谱峰的时间保留体积VR——进样到出现色谱峰时消耗的流动相体积死时间t0——流动相流过色谱柱的时间死体积V0——色谱柱的空隙体积校正保留时间'Rt校正保留体积'RV0'tttRR0'VVVRRFtVRRF——流动相流动线速度（4）相对保留值''''1.21212RRVVttrRR（5）分配系数和分配比（容量因子）分配系数：一定温度与压力下两相达平衡后，组分在固定相和流动相浓度的比值mSCCK分配比（容量因子）：一定温度与压力下两相达平衡后，组分在固定相和流动相量的比值qpk固定相重量流动相重量ssmSVVkVqVpCCK00//K与k的关系：（6）容量因子k与保留值的关系000'tttttkRR)1(0kttR4.分离效能指标1、选择性（相对保留值）1212''1.212KKkkttrRR相对保留值由两组分的热力学性质决定，与色谱柱的长短粗细无关。2、峰宽度3、分离度21212bbRRWWttR分离度考虑了保留时间和峰宽度，是一个综合指标：R1.0两峰明显重叠R=1.0两峰达97.7%分离R1.5两峰完全分开第二节色谱理论一、塔板理论(马丁，1904)目的——从理论上得到描述色谱流出曲线的方程，并通过这一方程各参数来研究影响分离的因素。假设（1）色谱柱存在多级塔板;（2）组分通过时在每级塔板两相间达到一次平衡;effeffnLH/221'2'2')(54.5)(16)(WtWttnRbRReff22122)(54.5)(16)(WtWttnRbRRr0r1r2。。。。。。。rnneff与n的关系：2')(Refftn2)(Rtn2002'])1([)(ktktttnnRReff2)1(kknneff二、速率理论1、塔板理论的不足塔板理论虽然指出了理论板数n或理论板高度H对色谱柱效率的影响，但是没有指出影响塔板高度的因素，因此无法在理论指导下从实验上提高色谱柱的效率。2、VanDeemter方程1956年VanDeemter提出速率方程，指出了提高柱效率的途径：VanDeemter方程CuuBAH式中u——流动相流动的线速度（1）A——涡流扩散项：指固定相填充不均匀引起的扩散dpA2——为填充的不规则因子dp——固定相颗粒粒径涡流扩散示意图（2）B/u——纵向分子扩散项指分子沿色谱柱轴向扩散引起的色谱谱带展宽B=2rDm式中：r——弯曲因子，填充柱r1空心柱r=1Dm——组分在流动相中的扩散系数由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的1/105，因此在液相色谱中B可以忽略。（3）Cu——传质阻力项指组分在流动相和固定相之间传质的阻力mpsfDdkkDdkkqC2222)1()1(固定相传质阻力流动相传质阻力q和为与两相的构型和性质有关的常数dp和df为固定相颗粒直径和固定液膜的厚度综上所述，速率方程为：uDdkkuDdkkquDrdpHmpsfm2222)1()1(22问题：1、怎样装柱才能使色谱柱的效率提高？提高柱效，与柱的种类（毛细管柱还是填充柱）、柱的填充均匀性、载体的颗粒度、载气的种类和相对分子量质量、固定液、也莫得涂覆厚度也和均匀度、柱温等多种因素有关。2、空心柱是否能够用于色谱分离？3、如何获得色谱最佳流速？0dCuuBddAdHu在上述方程各项中存在矛盾，因此，应求出最佳值：H-u曲线GC:H=A+B/u+C.uHPLC:H=A+C.u3、影响谱带展宽的其它因素柱前展宽、柱后展宽、柱外效应速率理论研究的是柱内峰展宽因素，实际在柱外还存在引起峰展宽的因素，即柱外效应（色谱峰在柱外死空间里的扩展效应）。色谱峰展宽的总方差等于各方差之和，即：σ2＝σ2柱内＋σ2柱外＋σ2其它柱外效应主要由低劣的进样技术、从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起。为了减少柱外效应，首先应尽可能减少柱外死体积，如使用零死体积接头连接各部件，管道对接宜呈流线形，检测器的内腔体积应尽可能小。三、分离条件的选择综合塔板理论和速率理论，可获得影响色谱分离效率的因素：2121212''2bRbbRRWttWWttRR22')(162bReffWtneffRbntW'224effRbRntttWttRRRR'''''2122124effnrrR1,21,241nkkrrR11411,21,2从式中看出，可以通过提高塔板数n，增加选择性r2,1、容量因子k来改善分离度。增加柱长、制备性能优良的色谱柱可以提高n值；改变固定相，使得各组分的分配系数有较大差别，可以增加r2,1；改变柱温可以使得k改变。色谱的基本概念气相色谱液相色谱提纲气相色谱法特点•1.选择性高，能分离分析极性极为接近的物质。•2.灵敏度高可以分析10-11~10-13g的物质，非常适合于微量和痕量分析；•3.分离效能高；能短时间分析复杂的混合物•4.分析速度快一般只需几分钟到几十分钟便可以完成一个分析周期•5.应用范围较广可以分析气体、易挥发液体和可衍生为易挥发的固体物质一、气相色谱仪载气净化器流量计色谱柱柱箱汽化室检测器记录器进样放空气相色谱仪流程图载气系统进样系统色谱柱检测器记录系统1、载气系统载气由压缩气体钢瓶供给，经减压阀、稳压阀控制压强和流速，净化器净化，试样从进样器注入到气化室后，立即气化并被载气带入色谱柱进行分离。分离后的组分依次进入检测器，产生的信号经放大后在记录仪上记录下来，得到色谱图。常用的载气：氮气氢气氦气氩气气相色谱对载气的基本要求：（1）纯净通过活性炭或分子筛净化器，除去载气中的水分、氧等有害杂质。（2）稳定采用稳压阀或双气路方式：载气气相色谱仪的流动相----载气•氦气（纯度99.99%以上）•氮气（纯度99.99%以上）•氩气（纯度99.99%以上）特殊分析使用•氢气（纯度99.99%以上）注意安全进样系统将液体试样瞬间气化的装置对汽化室的要求是：（1）体积小；（2）热容量大；（3）对样品无催化作用毛细管色谱常用1μL全自动液体进样器填充柱色谱常用10μL进样器气化室控制面板CombiPal三合一装置顶空加热装置自动进样器利用被测样品（气-液和气-固）加热平衡后，取其挥发气体部分进入气相色谱仪分析。静态顶空萃取进样方式固相微萃取液体直接进样载气入口接色谱柱散热片加热块汽化室示意图热进样和冷进样•热进样–分流/无分流进样–直接进样（全量注入）•宽口毛细柱和填充柱•冷进样•冷柱头进样•PTV进样歧视效应和热分解•热进样(SPL,WBI)–存在歧视现象和样品热分解•冷进样(OCI,PTV)–进样是在较低温度下进行–定量精度高歧视效应和热解效应的影响小歧视效应的产生•歧视:蒸溜现象形成气溶胶分溜现象低沸点组分百分比偏高进针退针高沸点组分残留•进样体积越小，歧视现象越严重。减小热进样歧视现象的方法•快速进样法•溶剂冲洗法•热针法溶剂冲洗法蒸溜和分溜减少溶剂空气样品空气分流比常20:1原因：柱容量小分流技术毛细管柱进样量必须极小（一般液样10-2～10-3微升，气样约1微升）何时不用分流？填充柱毛细管柱(开管柱)内径粗3-5mm柱长1-3m/常用不锈钢内径细0.2-0.5mm柱长20-100m/常用石英过去时现在时色谱柱3、分离系统目前GC的主流主要为开管柱opentubularcolumn管内壁涂渍固定液，无载体空心管主要特点分离能力强分析时间快柱容量小适用更复杂对象高载气流速进样量小/分流毛细管色谱柱的特点（1）固体固定相：固体吸附剂包括活性碳、硅胶、Al2O3、分子筛等；用于H2、O2、N2、CO、CO2、C1-C4等气体分离；（2）液体固定相担体固定液固定相担体选择：（A）表面有微孔结构，孔径均匀，比表面积大。（B）化学和物理惰性，即与样品组分不起化学反应，无吸附作用或吸附力很弱。（C）有一定的机械强度和浸润性，不易破碎。应用最普遍的担体为硅藻土型载体。（D）具有一定的粒度和规则的形状，最好是球形固定液的要求：（A）在使用温度下是液体，应具有较低的挥发性。（B）良好的热稳定性。（C）对要分离的各组分应具有合适的分配系数。（D）化学稳定性好，不与样品组分、载气、载体发生任何化学反应。固定液的分类：（A）非极性固定液常见的固定液有角鲨烷（异三十烷）、阿皮松等，适合非极性和弱极性化合物分析。组分按照沸点由低到高顺序流出。（B）中等极性固定液常见的固定液有邻苯二甲酸二壬酯、聚酯等，适合弱极性和中等极性化合物分析。组分基本上按照沸点顺序出峰，通沸点的非极性组分先出峰。（C）强极性固定液常见的固定液有氧二丙腈等。适合极性化合物分析。（D）氢键型固定液常用的固定液有聚乙二醇、三乙醇胺等，适用于分析含F、N、O等化合物。固定液的选择：依据极性原则（A）按极性相似原则选择如果固定液与待测组分的极性相似，则两者之间的作用力就强，待测组分在固定液中的溶解度就打，分配系数就大保留时间长，若分离极性和非极性混合物时，一般选用极性固定液，此时非极性组分先出峰。（B）按官能团相似选择若待测组分为酯类，则祖安用酯或聚酯类固定液；若待测组分为醇类，可选用聚乙二固定液。（C）按主要差别选择若待测组分之间的沸点是主要差别，可选择非极性固定液；若极性是主要差别，则选用极性固定液。在实际工作中遇到的样品往往是比较复杂的，所以固定液的选择要根据样品而定，一般依靠经验或参考文献，按照最接近的性质来选择。进样量的改变对分离的影响12121267ng完全分离335ng峰分離但峰较宽670ng不完全分离色谱柱：CBP1-M25-025柱温：50℃分流比：1:30１．１，４－二恶烷２．醋酸丙脂膜厚对毛细柱分离的影响CBP1-W25-100膜厚1umCBP1-W25-500膜厚5um毛细柱的内径、膜厚及柱容量内径膜厚柱容量出现鬼峰的原因1.进样口污染2.载气含水分及它不纯物其3.不锈钢管及阀污染4.进样垫及橡胶垫圈污染5.填料老化不足6.填充剂劣化色谱柱的老化•为什么必须进行色谱柱老化？新色谱柱含有溶剂和高沸点物质，所以基线不稳，出现鬼峰和噪声；旧柱长时间未用，也存在同样问题。一般采用升温老化，即从室温程序升温到最高温度，并在高温段保持数小时。新柱老化时，最好不要连接检测器。•每天都要进行老化吗？视仪器基线情况，确定是否需要老化以及老化时间。色谱柱分离效率评价•色谱柱效率：峰尖评价：理论板高(HETP)、理论塔板数(N)对策：将VanDeemter各因素优化•选择性：峰的分离度评价：分离因子或分离度对策：选择极性相当的固定相•峰的对称性：吸附现象评价：拖尾因子对策：色谱柱进一步老化4、控温系统作用、K是热力学常数，随温度变化，