色谱分离与拆分新技术

色谱分离与拆分新技术（一）色谱分离从20世纪80年代起色谱法成为立体异构体分离中的一个主要方法，气相色谱（gaschronmatography,LG）、液相色谱（liquidchromatography,LC）超临界流体色谱（sepercriticalfluidchromatography,SFC）和分子烙印法（molecularimprinting,MI）等色谱手段在立体异构体分离中均有应有。利用色谱方法分离手性药物或手性中间外消旋体，不仅广泛用与立体异构体的含量分析，而且在工业生产中发挥着重要作用。LC分离立体异构体，可分为间接法和直接法。间接法又称手性试剂衍生化法，手性试剂衍生法指外消旋体与一种手性试剂反应，形成非对映异构体，可用普通的正相或反相柱分离，衍生化还可改善色谱性能及增加检验灵敏度。列如（+）萘普生（4——15）与（-）-a-笨基-b-羟已胺、（-）-a-苯已胺或（-）-丝氨酸甲酯反应生成（+-）-萘普生酰胺，经高效液相色谱分离，拆分收率接近定量。直接法又分为手性固定相法（chiralststionnalphase,CSP）手性流动相添加剂法（chiralmobilephase，CMPA）。其中CSP应用较多，已发展成为吨级手性药物拆分的工艺方法。手性固定相可分为蛋白质类键合相、手性聚合物相、环糊精相、氢键和电荷转移类键合相配位基交换相等。手性固定相与被拆分的外消旋体相互作用，形成一对非对映异构体，亲和力有差别，即其中之一被拆分的比较牢固，而另一个比较弱，因此，再洗脱过程中，吸附弱的对映体比较容易通过色谱柱而先被洗脱出来，吸附牢固的对映体洗脱速度较慢，从而达到拆分的目的。（二）拆分新技术1.模拟移动床色谱在色谱柱中，流动相带着样品向前移动通过固定相，样品中的各个组分与固定相的亲和力不同，如果色谱柱足够长，即可达到各个组分分离的目的，这是固定床色谱的的工作过程。如果固定相同时向后坐相对移动，则意味着可以缩短柱长，这是模拟移动床色谱（simulatedmovingbedchromatography,SMBC）的工作原理,SNBC是介于固定床和移动床之间的操作方式。实际操作中，将手性色谱柱首尾两端相连接形成闭路循环，固定相保持不动，移动样品溶液和流动相和注入口和分离后两种组分定的取出口的位置。将外消旋体样品溶液注入已泵入流动相的色谱柱，一段时间后，组分分离逐渐形成两个峰，每一个峰含一个异构体。准确计算样品在色谱柱中的位置，分别移出分离后的两个单一异构体，再注入新的外消旋体样品，再另一处注满流动相，如此反复，完成异构体的分离，见图4—12.现在已开发出专用的手性软件（chirtase）和数据库，可用于过程才做和优化参数，加快研究进度，在连续生产过程中，样品注入和取出的时间及其位置均由计算机控制，并且实现自动化切换。列如药物中间体2，3-环氧-5-甲氧基四氢萘的手性分离，纤维素三乙酸酯为固定相，甲醇做流动相，以目标异构体计，收率100%，普通LC分离收率70%。ＳＭＢＣ和普通ＬＣ处理１g消旋体分别需甲醇０.３２kg和０.２４kg，这是因为ＳＭＢＣ中样品的浓度时普通ＬＣ的１５倍。2.超临界流体色谱超临界流体色谱（SFC）时一种流动相温度、压力均高于或低于临界点的色谱技术。SFC流程主要由高压流动相输送系统、色谱分离系统和检测系统三部分组成。高压流动相输送系统的作用是将高压气体经压缩和热交换转变为超临界流体，并以一定阳历连续输送到色谱分离系统；色谱柱分为填充柱和毛细管柱两种；检测器分为HPLC和GC型两类，分别适合于填充柱SFC和毛细管柱SFC。SFC分离手性化合物可分为直接法和间接法两种，直接法包括使用手性固定相和手性流动相；间接法则基于手性衍生化，将对映物转化为非对映物，然后用非手性固定相分离。超临界流体具有粘度小、扩散系数打、密度高等特点，因此，与常规的HPLC、工程技术相比，SFC手性分离技术具有以下显著特点：①由于SFC流动相的扩散系数\传质速度及最佳速度都比HPLC高,所以,SFC在单位时间内能达到更高的分离度,而且有机溶剂的消耗量降低;②SFC的分离温度比GC底低得多,选择性比GC高的多;分离温度低意味着外消旋化作用降低,还可以防止手性固定相和样品的热分解,SFC特别适合于热敏性物料的分离;③SFC可与HPLC\GC检测器匹配,可与MS\FTIR等大型机联用,实现定性\定量检测;④与HPLC\GC相比,SFC可以简单地将产品与溶剂分离，后处理简单，产品纯度高。SFC手性分离技术可以有效地弥补HPLC和GC在分离手心物质方面的不足。3.逆流提取技术具有对映体选择性的逆流提取技术（countercurretextractiontechnique,CET）是90年代发展起来的新技术。下面以去甲肾上腺素（4-9）外消旋体拆分为例，说明CET的操作与分离过程（4-13图）。10%D-酒石酸二已酯的正庚烷溶液和10%L-酒石酸二已酯的正庚烷溶液分别在水饱和的纤维膜形成的两个独立的管道中以相反方向流动，水饱和的纤维素膜将两种溶液分开。酒石酸二已酯和正庚烷都是疏水性物质，不能透过水饱和和纤维膜。将去甲肾上腺素（4-9）的外消旋体溶液加至某一溶液中。具有极行氨基醇结构的去甲肾上腺素（4-9）可自由透过纤维素膜，与酒石酸二已酯形成配合物；每一种立体异构体育两种不同立体异构体型的酒石酸酯之间的亲和力不同，倾向于形成稳定的化合物。随着液体的流动，（4-9）的两种异构体分别在膜的两侧，即两种酒石酸二已酯溶液中富集，达到分离异构体的目的。4.包结拆分包结拆分（inclusionresolution）是80年代出现的心方法，手性主体化合物通过氢键及分子间的次级作用，如π—π作用，选择性的与客体分子中的一个对映异构体形成稳定的超分子化合物，即包结配合物（inclusioncomplex）析出结晶，实现对映体的分离。包结配合物的形成要求主客体分子间从在强的分子识别作用。与经典的成盐拆分相比，主体与客体之间不发生化学反应，通过分子间的作用实现拆分，因此被拆分化合物不局限于有机酸和有机碱，主体和客体的分离可采用色谱法、容积交换和逐级蒸馏等手段，并实现客体的循环使用。包结拆分法操作简单，适合于规模生产，具有很高的工业价值。