搜索
色谱联用技术在生药学研究中的应用摘要：本文介绍了近年来HPLC–MS联用技术在中药指纹图谱建立、结构鉴定以及定量分析等方面的应用及其发展前景。以及GC/MS在中药材鉴定、中成药分析、药效学研究和药动学研究中的应用极其发展前景。关键词：HPLC–MSGC/MS鉴定分析Abstract:InrecentyearswereintroducedinthisarticleandHPLC-MSdetectionintraditionalChinesemedicine(TCM)fingerprintisestablished,thestructureidentificationandquantitativeanalysisoftheapplicationanddevelopmentprospect.AndtheanalysisoftheGC/MSintheidentificationofChinesemedicinalmaterials,proprietaryChinesemedicine,theapplicationofthepharmacodynamicandpharmacokineticresearchprospects.Keywords:HPLC-MSanalysisofGC/MSidentification色谱联用技术，就是采用色谱技术将复杂体系加以分离，再用红外光谱、质谱或核磁共振等波谱学或光谱学等的技术分别提供其结构信息，这为复杂体系的分离分析研究提供了一种具有发展前景的新技术。色谱联用技术包含了多种联用方式和技术，色谱方法主要包括高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、毛细管电色谱(CEC)和高效毛细管电泳(HPCE)等几种分离手段同四大谱即质谱、核磁共振、红外、紫外光谱的分别联用组成了色谱联用技术的丰富内涵，此外还有与其他技术的联用应用。由于对复杂体系分析信息量的要求日益增高，各种联用均得到较大发展，其中最引人注目的是色谱与质谱的成功联用，主要包括气相色谱—质谱(GC／MS)和液相色谱—质谱(LC／MS)。另外，正处于快速发展阶段并广泛应用的色谱联用技术包括气相色谱／傅立叶变换红外光谱(GC—FTIR)、气相色谱／原子光谱(GC—AS)、液相色谱／电感耦合等离子体质谱(HPLC-ICP—MS)、液相色谱／二极管阵列检测／质谱／质谱联用(LC—DAD—MS-MS)、毛细管电泳／质谱联用(CE-MS)等。色谱联用技术在生物样品分析、食品分析、环境分析、药物方面等表现出了一定的优越性。本文着重介绍液质联用与气质联用。1液相色谱与质谱联用技术HPLC-MS主要由高效液相色谱仪、接口、质量分析器、真空系统和计算机数据处理系统组成。混合样品通过液相色谱系统进样,由色谱柱分离。从色谱仪流出的被分离组分依次通过接口进入质谱仪的离子源处并被离子化,然后离子被聚焦于质量分析器中,根据质荷比而分离,分离后的离子信号被转变为电信号,传送至计算机数据处理系统,根据质谱峰的强度和位置对样品的成分和结构进行分析[1,2]。目前常用的HPLC-MS联用仪具有两大分类系统,一种是从质谱的离子源角度来划分,包括电喷雾离子(electrosprayionization,ESI),大气压化学电离(atmosphericpressurechemicalionization,APCI)和基质辅助激光解吸离子化(matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI)等;另一种是从质谱的质量分析器角度来划分,包括四级杆质谱仪(quadrupole-MS,Q-MS),离子阱质谱仪(iontrap-MS,IT-MS),飞行时间质谱仪(timeofflight-MS,TOF-MS),傅立叶变换质谱仪(fouriertransform-MS,FT-MS)[3]。从离子源角度来看,ESI从去除溶剂后的带电液滴形成离子,具有多电荷能力,所以其分析的分子量范围很大,既可用于小分子分析,又可用于多肽、蛋白质和寡聚核苷酸分析,尤其适用于在溶液中已形成离子的化合物或能够带多电荷的生物大分子的分析。APCI是在大气压下利用电晕放电来使气相样品和流动相电离的一种离子化技术,要求样品有一定的挥发性,适用于非极性或低、中等极性的化合物。由于极少形成多电荷离子,分析的分子量范围受到质量分析器质量范围的限制。MALDI是将溶于适当基质中的样品涂布于金属靶上,用高强度的紫外或红外脉冲激光照射可实现样品的离子化。由于MALDI的灵敏度很高,且对高浓度的非易失性盐的响应不如ESI灵敏,因此将MALDI与液体样品的引入进行联用引起了广泛的兴趣。MALDI与TOF-MS联用测定高质量数的分子,其灵敏度高,样品制备简单,现已广泛应用于分析蛋白质、肽类、核苷酸、多糖类物质。从质量分析器角度来看,Q-MS中样品在第一个四极质量分析器中进行质量分析,然后按质荷比选择离子,选定的离子在第二个四极质量分析器中进行碰撞诱导裂解产生一系列新的产物离子。产物离子被第三个四极质量分析器检测,进行两极分析,从而提高分析选择性和灵敏度。IT-MS由中间的类似四级杆的环形电极和两个端盖电极构成,端盖电极施加直流电压,环电极施加射频电压,通过施加适当电压就可以形成一个势能阱(离子阱)。根据射频电压的大小,离子阱就可捕获某一质量范围的离子。离子阱可以储存离子,待离子累积到一定数量后,升高环电极上的射频电压,离子按质量从高到低的次序依次离开离子阱,被电子倍增监测器检测。离子阱既能直接用于质荷比离子的检测,又能实现串联质谱。TOF-MS应用不同质量的离子不同飞行速度,离子飞行通过相同的距离到达检测器的时间不同而获得质量分离,与MALDI联用,具有较大的质量分析范围和较高的质量分辨率。FT-MS应用快速傅立叶变换方法将离子的频率信号转换为质谱信号,其优点为分辨率高[4]。1.1在中药指纹图谱研究中的应用张尊建[5]等采用HPLC-UV-MS法对密花石斛进行指纹图谱研究，标示了9个共有峰，对其部分色谱峰进行了初步定性，有泽兰内酯、鼓槌联苄、大黄素或芦荟大黄素等。此外，他们[6]还采用HPLC-UV-MS法对忍冬和山银花药材进行指纹图谱的研究，确认了忍冬指纹图谱中的8个色谱峰(熊果酸、绿原酸、十三烷酸、香芥酚、corymbosin、3-甲基-4-羟基肉桂酸、异绿原酸、丁香酚等)和山银花图谱中的5个色谱峰(绿原酸、香芥酚、丁香酚、异绿原酸、咖啡酸等)，并比较了2种药材指纹图谱的差异。李松林[7]等应用HPLC-DAD-MS联用技术测定四川GAP示范基地3个公司的9个川芍样品，结果有21个共有峰，通过参考文献资料鉴定l1个色谱峰对应之化合物：阿魏酸、川芎酽内酯Ⅰ和H、Coniferylferulate、藁本内酯等。所建立的液相色谱指纹谱特征性和专属性强，可作为川芎药材内在质量控制的有效方法。余静[7]等采用HPLC-UV-MS法分别对刺五加药材水溶性和脂溶性成分进行指纹图谱研究，并分别对水溶性成分指纹谱中5个色谱峰和脂溶性成分指纹图谱中8个色谱峰进行了初步定性。根据化合物的质荷比、提取离子色谱(EIC)以及相关文献，对图中主要色谱峰进行了初步归属，主要成分为丁香苷、绿原酸、异绿原酸、咖啡酸、刺五加苷Bl、芥子醛等。两张指纹图谱相互补充，为剌五加药材的相关研究提供了较全面的参考。由于中药复方制剂成分复杂，现行的各种单一测定法提供的信息量少，无法建立较完善的指纹图谱，因此有人提出建立多维指纹谱尝试解决该问题。其建立既能较系统、完整地解决中药复方制剂质量控制难题，又可为中药研究中缺乏标准品的难题提供一种新的解决途径[8]。马欣[9]等应用HPLC-DVD-MS2法建立了银杏叶提取物的多维指纹图谱，同时建立了质谱总离子流(TIC)指纹图谱，检测了银杏叶中四种有效成分(黄酮和内酯类化合物)。样品经前处理后，应用AgilentHPLC色谱条件和API-ES-MS条件分析了法国、香港、山东等10个厂家样品。结果提取物的HPLC有33个峰，MS总离子流有51个峰。并以芦丁为参照物，计算了样品的相似度。戴德舜[10,11]等在研究桂枝汤指纹图谱时，采HPLC-MS-MS等法对其中具有双向调节作用的A部分、5种单味药A部分及各单味药按收率和组方用量配比制得的A部分进行指纹图谱测定，并将其阐述为多维全息化学特征谱，对桂枝汤A部分产生双向调节作用的物质基础作了初步讨论，说明多维化学特征谱提供的大量信息可较好地反映复方及单味药物信息，所显示的各项参数如能配合一定指标的成分信息，将成为复方质量控制的有效指标，并可在一定程度上作为药效特征的有力佐证。多维指纹图谱专属性强，因为对中药中某成分有保留时间、UV图谱、相对分子量和特征碎片4种信息，为中药研究中缺乏对照品提高了可能性。1.2在中药结构鉴定中的应用采用HPLC-MS联用技术，在对未知成分的研究中，质谱检测器可以给出大量的结构信息，结合同类已知结构化合物的裂解规律，或结合其它检测方法，即可对未知成分结构进行直接分析。孙秀燕等[12]采用HPLC-MS联用仪，ESP-IT-MS对滨蒿中利胆保肝活性成分进行了分离和结构鉴定，鉴定出滨蒿中的利胆有效成分除含有绿原酸、对羟基苯乙酮、6，7-二甲氧基香豆素外，还首次分离鉴定出具有保肝活性的茵陈色原酮。Miketova等[13]利用HPLC-ESI-MS技术对绿茶提取物直接进行分析，结合不同化合物的相对分子质量和保留时间信息，可对所含的儿茶酸类进行有效鉴定。He等[14]同时利用HPLC-MS、HPLC-DAD成功地对姜的辛辣成分与含油树脂提取物进行了成分分析，根据紫外吸收光谱和质谱结果，成功地鉴定了其中7个化合物结构，并分析推测了其他2个未知成分的结构。Ndjoko等[15]利用HPLC-TSP-MS并结合HPLC-TSP-MS-MS方法对大麻树脂提取物中的大麻酚类进行定性分析，在3份不同的大麻树脂提取物样品中，共鉴定分析了Δ9THC(m/z3l5)等l1个成分。Fuzzati等[16]利用HPLC-MS直接分析了人参根提取物中含有的人参皂苷，共检测到25种人参皂苷，获得人参皂苷所连的糖基和苷元结构。Wolfender等[17]分别对热喷雾接口、恒流快原子轰击接口和ESI接口技术，对提取物进行HPLC–MS分析的应用研究中，认为HPLC-TSP-MS适用于中等极性的化合物，如多酚类，萜类化合物；恒流快原子轰击接口及ESI接口更适合于分析相对分子质量和极性较大的化合物。由于粗提物中通常含有不同类型的化合物，应用不同类型的离子化方式对其进行分析，以取各组分完整的信息。1.3在中药定量分析中的应用HPLC-MS与多级反应监测技术结合可进行天然药物提取物中成分的定量分析。其具有高灵敏度、高选择性，适用于对热不稳定化合物的分析等特点。徐智秀[18]等采用惠普公司HypersilODS色谱柱，以乙腈一水梯度洗脱,分离出9种人参皂甙，用二极管阵列检测器检测并在202nm下提取色谱图。利用三极四极质谱研究了9种人参皂甙的一级质谱和二级质谱，采用内标、外标法对人参皂甙进行了定量分析。Chauvaux等[19]HPLC-ESI-MS-MS对植物组织中微量成分氨基环丙烷羧酸进行了定量分析，并对烟草的根、茎、叶提取物中的氨基环丙烷羧酸进行了定量分析。由于测定方法的高度特异性，测定内源性的氨基环丙烷羧酸不需提纯。尽管样品的成分非常复杂，色谱条件仍可优化至被分析成分与干扰成分很好地分离，并能l2min内完成分析测试。1.4在中药代谢产物鉴定中应用HPLC-MS联用技术在分析中药代谢产物时,由于其选择性强、灵敏度高且可以获得复杂混合物中单一成分的质谱图,有利于中药、中药药物代谢产物和内源性化合物的分离和鉴定。HPLC-MS联用技术能够直接分析溶液样品,特别适合分析复杂介质中强极性、难挥发或热不稳定的化合物,在中药代谢产物研究中得到广泛应用。MutoR等[20]利用HPLC-ESI-MS,以电化学检测器作检测装置分析黄芩苷在体内的代谢产物,结果达到了很好的分离鉴别