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讨论定量时选择峰高还是峰面积的问题（1）在色谱定量分析中，选用峰高还是峰面积法，主要取决于在检测器的线性范围内，峰高和峰面积测量的准确性和重复性。（2）除了归一化法最好用峰面积法外，其他三种定量方法中峰高和峰面积都可以用作定量。（3）在检测器的线性范围内，峰高和峰面积测量的准确性受色谱分离度的影响，因此要准确的测量峰高和峰面积，要具有一定的分离度。（4）在分离度好，色谱峰型好，峰面积可以准确测量时，用峰面积法定量为好。（5）在气相色谱使用程序升温和液相色谱使用梯度洗脱时，最好用峰面积法定量。（6）分离度不好，色谱峰型较差（如严重拖尾）时，峰面积测量的误差较大，此时应选择峰高法定量。（7）保留时间短、峰尖（峰尾宽较小）时峰高定量要优于峰面积，否则就应选择峰面积法定量。以上内容来自《最新色谱分析检测方法及应用技术实用手册》唾液淀粉酶的性质和活力测定目的要求通过唾液淀粉酶性质的测定，了解酶的专一性和多种因素对对酶促反应的影响，如：底屋的浓度，酶浓度，温度、PH值、激活剂等。通过对唾液淀粉酶活力的测定，学习酶活力、蛋白质含量的测定方法、及酶活力和比活力的计算方法。原理：一，考马斯亮法测定蛋白质浓度考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’slaw）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。二3，5—二硝基水杨酸比色定糖法3,5----二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈现比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。该方法是半微量测糖法，操作简便，快速，杂质干扰较小。三，研究底物，温度、pH、激活剂及抑制剂对酶促反应速度的影响在其他条件不变的情况下，当酶浓度一定时，增加底物浓度，反应速度随底物浓度而增加，两者成正比关系，即V=kC液。酶的催化作用受温度的影响很大，一方面与一般化学反应一样，提高温度可以增加酶促反应的速度。通常温度每升高10摄氏度，反应速度加快一倍左右，最后反应速度达到最大值。另一方面酶是一种蛋白质，温度过高可引起蛋白质变性，导致酶的失活。因此，反应速度达到最大值以后，随着温度的升高，反应速度反而逐渐下降，以至完全停止反应。反应速度达到最大值时的温度称为某种酶作用的最适温度。高于或低于最适温度时，反应速度逐渐降低。大多数动物酶的最适温度为37-40摄氏度，植物酶的最适温度为50-60摄氏度。但是，一种酶的最适温度不是完全固定的，它与作用的时间长短有关，反应时间增长时，最适温度向数值较低的方向移动。通常测定酶的活性时，在酶反应的最适温度下进行。为了维持反应过程中温度的恒定，一般利用恒温水浴等恒温装置。酶对温度的稳定性与其存在形式有关。实践证明大多数酶在干燥的固体状态下比较稳定，能在室温下保存数月以至一年。溶液中的酶，一般不如固体的稳定，而且容易为微生的污染，通常很难长期保存而不丧失其活性，在高温的情况下，更不稳定。酶的活性受环境pH的影响极为显著。通常各种酶只有在一定的pH范围内才表现它的活性。一种酶表现其活性最高时的pH值，称为该酶的最适pH。低于或高于最适pH时，酶的活性逐渐降低。不同酶的最适pH值不同，例如，胃蛋白酶的最适pH为1.5-2.5，胰蛋白酶的最适pH为8等。应当指出酶的最适pH受底物性质和缓冲液性质的影响。例如，唾液淀粉酶的最适pH约为6.8，但在磷酸缓冲液中，其最适pH为6.4-6.6，在醋酸缓冲液中则为5.6。酶的活性常受某些物质的影响，有些物质能使酶的活性增加，称为酶的激活剂；有些物质能使酶的活性降低，称为酶的抑制剂。例如，氯化钠为唾液淀粉酶的激活剂，硫酸铜为其抑制剂。很少量的激活剂或抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特异性。值得注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。例如，氯化钠达到1/3饱和度时就可抑制唾液淀粉酶的活性。唾液淀粉酶可催化淀粉水解生成葡萄糖，其具有还原性，在碱性溶液中还原糖变成稀二醇其易被氧化还原糖和碱性饿2硝基水杨酸共热昌盛红棕色化合物，在一定浓度范围内，红棕色和深浅程度与还原糖的量成正比，可用分光光度发测定样品中还原糖的总量。溶液吸光度与溶液浓度和液层的厚度的乘积成正比。四，酶活力测定在最适条件下，每分钟催化单位量的底物转化为产物所需的酶量定义为一个活力单位酶的比活力：用每mg蛋白质酶活力单位数表示，表示酶的纯度。每隔一段时间测定一次水解的横渡一浓度为纵坐标，时间为横坐标作图，在图上找出开始部分线形好的部分求出斜率。进而求出酶的活力与比活力。试验器材和试剂：试剂：（1）一，考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G―250100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(W/V)乙醇。二，3,5----二硝基水杨酸试剂（又称DNS试剂）：甲液——溶解6.9g结晶酚于15.2ml10％氢氧化钠中，并稀释至69ml，在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠。乙液——称取255g酒石酸钾钠，加到300ml10％氢氧化钠中，再加入880ml1％3,5----二硝基水杨酸溶液。将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中，在室温下放置7－10天以后使用。（2）0,1％葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯的葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后定容至100ml，冰箱保存备用。（3）未知葡萄糖溶液冰箱保存备用（4）6mol盐酸溶液（5）10％氢氧化钠溶液（6）碘化钾－碘溶液（碘试剂）（7）酚酞指示剂（8）85％乙醇三，10.3%氯化钠的0.2%的淀粉溶液20.3%氯化钠的0.5%淀粉溶液30.1%淀粉溶液（新鲜配制）4稀释200倍的唾液51%氯化钠溶液61%尿素溶液70.2M磷酸氢二钠溶液80.1M柠檬酸溶液90.1%硫酸铜溶液10碘化钾-碘溶液：将碘化钾20克及碘10克溶于100毫升水中，使用前稀释10倍。11脲酶提取液：取黄豆粉6克，加30%乙醇250毫升，振荡10分钟，过滤，可保存1-2星期。12奈斯勒（Nessler）试剂：称取5克碘化钾，溶于5毫升蒸馏水中，加入饱和氯化汞溶液（100毫升约溶解5.7克氯化汞），并不断搅拌。直至产生的朱红沉淀不再溶解时，再加40毫升50%氢氧化钠溶液，稀释至100毫升，混匀，静置过夜，倾出清液存于棕色瓶中。（奈斯勒试剂是含有大量汞盐的强碱性溶液，所以，它是具有腐蚀性的剧毒试剂。实验时必须严格遵守操作规程，谨防中毒。此外，作酶学实验时所用的玻璃仪器等一切器皿必须洁净，以除去能抑制酶活性的杂质。因此，用奈斯勒试剂作完实验后，必须将它所沾污的试管等一切器皿充分洗涤干净。）四，器材试剂见步骤。器材：一，试管及试管架，移液管（0.1ml及5ml），UV－2000型分光光度计二，（1）试管试管架（2）碱滴定管（50ml）。（3）铁台（4）滴定管夹（5）吸量管（1ml和2ml）和吸量管架（6）容量瓶(100ml)（7）铜水浴锅（8）玻璃漏斗和烧杯（9）铁三脚架（10）量筒（10ml、100ml）（11）电热恒温水浴（12）煤气灯（13）玻璃棒（14）白瓷板（15）72型分光光度计三，1试管和试管架2吸量管（0.512510亳升）3烧杯（500、100毫升）4锥形瓶（50100毫升）5玻璃漏斗6水浴7铁三脚架8煤气灯9恒温水浴10滤纸11滴管12量筒（100毫升）13玻璃漏斗14白瓷板15秒表唾液淀粉酶的性质和活力测定；一．实验目的；（一）1通过唾液淀粉酶性质的测定，了解酶的专一性；二．实验试剂和器材；器材：可见光分光光度计，试管，移液管，恒温水浴锅；药品：可溶性淀粉，考马斯亮蓝试剂G-250，3,；注：（1）考马斯亮蓝G-250试剂：考马斯亮蓝试；（2）标准牛血清白蛋白溶液：结晶牛血清白蛋白用凯；（3）配置0.01%g/ml,0.1%g/ml,唾液淀粉酶的性质和活力测定一．实验目的（一）1通过唾液淀粉酶性质的测定，了解酶的专一性和多种因素对酶粗反应的影响，pH，底物浓度，温度，激活剂，抑制剂等2学习酶活力，酶活力单位，比活力的测定，加深对概念的理解；3学会用考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量，学会用3,5-二硝基水杨酸测定还原糖的含量，熟练操作分光光度计。二．实验试剂和器材器材：可见光分光光度计，试管，移液管，恒温水浴锅，pH试纸，1000ml容量瓶和100ml的容量瓶各一只；药品：可溶性淀粉，考马斯亮蓝试剂G-250，3,5-二硝基水杨酸，NaoH,HCL，标准牛血清白蛋白溶液，醋酸，醋酸钠，蒸馏水，95%乙醇，85%磷,；0.15molNaCL/ml，0.15mol/L硫酸铜溶液，碘化钾–碘溶液：将碘化钾20克和碘10克溶解在100ml水中，使用前稀释10倍。注：（1）考马斯亮蓝G-250试剂：考马斯亮蓝试剂G-250100mg溶于95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，加水稀释至1000ml，过滤即可。（2）标准牛血清白蛋白溶液：结晶牛血清白蛋白用凯式定氮法测蛋白含量，根据其纯度用0.15mol/LNacl配置成0.1mg/L的蛋白液；（3）配置0.01%g/ml,0.1%g/ml,，0.5%g/ml,1%g/ml,2%g/ml,3%g/ml的的溶性淀粉溶液;(4)配置一系列pH2的缓冲溶液0.2Mol/L磷酸氢二钠溶液为28.40g/L,Mr=141.98,称取2.84g溶于100ml的水中5配置0.15mol/L的NaCL溶液和0.15mol/L硫酸铜溶液三．实验步骤（一）1pH的对酶的影响1）葡萄糖标准曲线的制定准确称取100mgAR纯的葡萄糖，溶于蒸馏水中，定容于100ml的容量瓶中，配成1.0mg/L的溶液，水浴加热5min，迅速取出冷却，在向每管加入21.5ml的蒸馏水于550nm处测吸光度；2）取一试管加入2ml淀粉并滴加两滴碘液，加入适量的酶，记录溶液颜色退去的时间，作为接下来各步反应的反应时间t；3）取十二只试管并编号分别加入2ml缓冲液加入2ml，0.1%淀粉，再加入适量的酶，反应t后加入3,5-二硝基水杨酸1.5毫升，水浴加热5min，迅速取出冷却，在向每管加入21.5ml的蒸馏水于550nm处测吸光度；4）由pH值和吸光度做曲线，找出最适pH值2温度对酶活性的影响1）取十只试管并编号，分别加入2ml，0.1%淀粉液和相同量的酶同时置于0---100，温度间隔10度，反应t后加入3,5-二硝基水杨酸1.5毫升，水浴加热5min，迅速取出冷却，在向每管加入21.5ml的蒸馏水于550nm处测吸光度；2）由吸光度和温度做曲线，找出最适温度值3底物浓度对酶活性的影响1）取十只试管并编号并编号1-10，由1,2步知最适温度和最适PH调节温度PH值至最合适，然后分别加入0.01%g/ml,0.1%g/ml,，0.5%g/ml,1%g/ml,2%g/ml,3%g/ml淀粉溶液2ml并加入等量的酶，反应t后加入3,5-二硝基水杨酸1.5毫升，水浴加热5min，迅速取出冷却，在向每管加入21.5ml的蒸馏水于550nm处测吸光度；2）做吸光度和底物浓度的曲线图，找出最适底物浓度；4激活剂和抑制剂对酶活性的影响取三试管并编号123，分别加入2ml0.1%淀粉溶液，加入最适pH值的缓冲液并在最适温度水浴中保温5min后加入1m稀释的唾液淀粉酶，T时间加入3,5-二硝基水杨酸1.5毫升，水浴加热5min，迅速取出冷却，在向每管加入21.5ml的蒸馏水于550nm处测吸光度；比较吸光度的大小；（二）酶活力和比活