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1.写出大多数限制性内切酶识别DNA序列的结构特点？生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶．Ⅱ型（typeⅡ）限制与修饰系统所占的比例最大，达93%。Ⅱ型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3'-羟基和5'-磷酸基团的DNA产物，需Mg2+的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需SAM。识别序列主要为4-6bp，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。Ⅱs型（typeⅡs）限制与修饰系统，占5%，与Ⅱ型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为4-7bp，切割位点可能在识别位点一侧的20bp范围内。Ⅱ型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在DNA链的两个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。在Ⅱ型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链DNA中的一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶（nickingenzyme），如N.BstNBI。2.PCR循环的参数是如何确定的？（1）变性时间是如何确定的？在选择的变性温度下，DNA分子越长，两条链完全分开所需的时间也越长。如果变性温度过低或时间太短，模板DNA中往往只有富含AT的区域被变性。在PCR的第一个循环中，有时常把变性时间设计为5min，来增加大分子模板DNA彻底变性的概率，又称此为预变性。当模板DNA的G+C含量超过55%时，需要更高的变性温度，来源于古细菌的DNA聚合酶比TaqDNA聚合酶更能耐受高温，因此更适合用来扩增富含GC的DNA模板。（2）复性温度的确定有什么考虑？复性过程（即退火）采用的温度至关重要。如果复性温度太高，寡核苷酸引物不能与模板很好地复性，扩增效率将会非常低。如果复性温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性的DNA片段的扩增。（3）延伸的时间是如何确定的？TaqDNA聚合酶在最适反应温度（72～78℃）下聚合速率约为2000bp/min。根据多数研究者的经验，确定了一个规则，即：靶基因的每1000bp的扩增产物的延伸时间被设计为1min，以此类推。对于PCR的最后一个循环，许多研究者常把延伸时间增加为以前循环的延伸时间的3倍以上，以使所有扩增产物完成延伸，这又称为后延伸。（4）循环数目一般都为30，这个数值是怎么来的？PCR扩增所需的循环数目决定于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的速率。一旦PCR反应进入几何级数增长期，反应会一直持续下去，直至某一成分成为限制因素。从这一点上来说，扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产物，而非特异性的扩增产物低到难以检测的程度。用TaqDNA聚合酶在一个含有105个拷贝的靶序列的反应体系中进行30个循环后往往可以做到上述的理想情况。3.SDS-PAEG主要涉及那些试剂？下层胶：上层胶：4.在最适条件下，细菌繁殖一代仅需25分钟，解释为什么细胞能这么快分裂(a)在复制原点形成两个复制叉,复制叉以相反的方向移动直到它们在原点对面的某一点相遇为止,因而每个复制体复制基因组的一半(2.6*106碱基对),在每一个复制叉上,以1000个核苷酸/秒的速率合成两条新链(前导链和滞后链)(2000个核苷酸/秒等于1000个碱基对/秒).所以复制全部的染色体需要2.6*106/1000=2600秒=43分20秒.(b)尽管仅仅只有一个原点(O),但在前一个复制叉到达终点位置之前复制可以反复起始.因而在每一个双链DNA分子上存在着2个以上的复制叉.虽然复制一个染色体仍旧需要大约43分钟,但是由于起始的速率加快,完全复制一个染色体显得间隔更短了.5.Pr合成体系的内容和各成分的作用pCR反应体系中包含特异性寡核昔酸引物.DNA模板、DNA聚合酶dNtP及含有必需离子的反应级冲液。一、寡核普酸引物PCR反应中的寡核廿酸引物至少应含有玲个与DNA模板序列完全互补的核节酸.皿好长达20一24个核普酸，这样才能保证扩增反应的特异性。低温冷却液循环泵寡核昔酸引物在NCR反应中的浓度通常是。.t一1.OlumWL,这一浓度足以完成30个循环的扩增反应。浓度过高会引起模板与引物的错配，影响咒R反应的待异性，同时使形成引物二聚体的概率增大，而且非特异产物和引物二聚体可与摸板竞争使用酶、引物和dN1'P等，从而导致产量的下降。反之，若寡核普酸引物浓度过低，会导致PCR效率的降低。二、DNA模板DNA摸板亦称为靶序列。它既可以是单链DNA.也可以是双链DNA,闭环DNA校板的扩墩效率略低于线状DNA，因此用质毯做模板时最好先将其线状化。DNA模板巾不能混有蛋白醉、核酸酶、DNA聚合醉抑制剂以及能与DNA结合的蛋白质等。在一定范围内、PCR的产址随DNA模板浓度的升高而显著增加，但模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。为保证反应的特异性，荃因组DNA做棋板时可用l滩左右，质位DNA做模板时用10ng鸣左右三、缓冲用于PCR的标准级冲液的主要成分通常有川J血一l1Cl和3i9C眨，其中二价镁离子的存在与否至关重要。镁离子浓度可直接关系DNA聚合敌的活性和DNA双链的解链温度，因此对反应的特异性及产证有显著影响。镁离子浓度过低会使DNA聚合酶活性降低、PCR产皿下降;镁离子浓度过高则影响PCR反应的特异性。钱离子的最佳作用浓度为1.5一2.0~，肠由于镁离子可与缓冲液中的鳌合剂(如EDTA)以及带负电荷的丛团(如磷酸根)结合.因此反应中游离的镁离子浓度取决于反应液中dN]P和EDTA的浓度。四、DNA聚合酶最早的PCR是采用大肠杆菌DNA聚合酶.的Kl}片段催化退火的寡核昔酸引物。在DNA模板上进行延仲反应。由于该酶会在DNA变性的拟度下失活.所以在每一轮合成反应中都必须巫新加人一份酶。这种反应在扩增小片段DN州《200bp)时效果尚可，但对于扩增更长的目的DNA则结果不够理想。同时这种反应的产率通常较低，产物的大小也不均一。耐热DNA聚合酶的应用使这些问题迎刃而解。耐热DNA聚合酶在951C下持续温育仍能保持活性，因此寡核节酸引物的退火和延仲可以在更高的温度下进行，使引物与校板的误配大大减少，扩增反应的特异性和产率大大提高，而更长的扩增产物也得以生成。现已发现多种耐热DNA聚合酶，其共同特点是在高温下仍保持一定的酶活性甲但其他性能有一定的差别。6.保证DNA正确复制的机制是什么（DNA的损伤修复系统？）1、复制时以一条链为模板进行半保留复制，且复制时严格按照碱基配对原则。2、DNA聚合酶具有反向校读机制，在复制中对错配碱基进行校正。3、DNA聚合酶可以将DNA链弯曲，防止非合成点对合成点的干扰。4、复制完成后若存在错误，DNA会启动修复机制，包括错配修复(DAM甲基化酶)、切除修复(DNA切割酶)、重组修复(DNA切割酶聚合酶)、DNA直接修复(dna光解酶)、SOS系统等。7.真核生物第Ⅱ类启动子的特点，与原核生物启动子的不同之处原核生物启动子：在基因或操纵子的终末往往具有特殊的终止顺序,它可使转录终止和RNA聚合酶从DNA链上脱落。例如大肠杆菌色氨酸操纵子后尾含有40bp的GC丰富区，其后紧跟AT丰富区，这就是转录终止子的结构。终止子有强、弱之分，强终止子含有反向重复顺序，可形成茎环结构，其后面为polyT结构，这样的终止子无需终止蛋白参与即可以使转录终止。而弱终止子尽管也有反向重复序列，但无polyT结构，需要有终止蛋白参与才能使转录终止。典型转录终止子的特征：茎环结构，富含GC；含4个以上的U。原核生物启动子序列包括：CAP序列，增强聚合酶的结合和转录的起始序列（-70~-40）；识别区（-35）；解旋区（-10）；转录起始位（+1）真核生物启动子：启动子（promoter）：真核基因启动子是在基因转录起始位点（+1）及其5’上游近端大约100~200bp以内（或下游100bp）的一组具有独立功能的DNA序列，每个元件长度约为7~20bp，是决定RNA聚合酶转录起始和转录频率的关键元件。启动子包括：A。核心启动子（corepromoter）：是指足以使RNA聚合酶Ⅱ转录正常起始所必需的、最少的DNA序列。其中包括转录起始位点或起始子（initiator）（+1）：一般是A或G及转录起始位点上游-25/-30bp处富含TA的典型元件TATA框。B。上游启动子元件(upstreampromoterelement，UPE)：包括通常-70bp附近的CAAT框：GGCCAATCT和GC框：GGGCGG等，能通过TFⅡ-D复合物调节转录起始的频率，提高转录效率。8.简述正常胆色素的代谢途径胆色素是体内铁卟啉化合物的主要分解代谢产物，包括胆红素、胆绿素、胆素原和胆素等。这些化合物主要随胆汁排出体外。胆红素是人胆汁的主要色素，呈橙黄色。（一）胆色素的生成与转运体内铁卟啉化合物包括血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素、过氧化物酶等。正常人每天可生成250～350mg胆红素，其中80％以上来自衰老红细胞在肝、脾、骨髓的单核-吞噬细胞系统破坏释放出血红蛋白。单核-吞噬细胞系统细胞微粒体含有非常活跃的血红素加氧酶，在氧分子和NADPH存在下，血红素加氧酶将血红素转化为胆绿素。胆绿素在胞液胆绿素还原酶的催化下，生成胆红素。胆红素离开单核-吞噬细胞后，在血液中主要与清蛋白结合而运输。这种紧密的结合不仅增高胆红素的水溶性，有利于运输，而且还限制胆红素通过细胞膜对组织的毒性作用。(二）胆红素在肝中的转变胆红素在被肝细胞摄取前先与清蛋白分离。肝细胞对胆红素有极强的亲和力，当胆红素随血液运输到肝后，可迅速被肝细胞摄取。胆红素进入肝细胞后，与胞浆中两种载体蛋白——Y蛋白和Z蛋白相结合形成复合物。Y蛋白是肝细胞内主要的胆红素载体蛋白。胆红素-Y蛋白复合物被转运到滑面内质网。在葡糖醛酸基转移酶的催化下，胆红素接受来自UDP-葡糖醛酸的葡糖醛酸基，生成葡糖醛酸胆红素。每分子胆红素可结合2分子葡萄糖醛酸。双葡糖醛酸胆红素是主要的结合产物少量为单葡糖醛酸胆红素。与葡萄糖醛酸结合的胆红素称为结合胆红素。结合胆红素水溶性强，随胆汁排入小肠。（三）胆红素在肠道中的变化在肠菌的作用下脱去葡萄糖醛酸基，并被逐渐还原生成胆素原、粪胆素原和尿胆素原。统称为胆素原。在肠道下段，这些无色的胆素原接触空气分别被氧化为相应的尿胆素、粪胆素和尿胆素。后三者合称胆素。胆素是黄褐色，是粪便的主要色素。胆道完全梗阻时，因胆红素不能排入肠道形成胆素原和胆素，所以粪便呈现灰白色。肠道中约10％～20％的胆素原可被肠粘膜细胞吸收，经门静脉入肝。再随胆汁排入肠道，形成胆素原的肠肝循环。少量经血入肾并随尿排出，胆素原接触空气后被氧化成尿胆素，后者是尿的主要色素。(四)血清胆红素与黄疸正常人体中胆红素主要以两种形式存在。一为由肝细胞内质网作用所生成的葡糖醛酸胆红素，这类胆红素称为结合胆红素；二为主要来自单核-吞噬细胞系统中红细胞破坏产生的胆红素，在血浆中主要与清蛋白结合而运输，称为游离胆红素。这两种胆红素的反应性不同，游离胆红素与一种重氮试剂反应缓慢，必须在加入乙醇后才表现出明显的紫红色；结合胆红素可与重氮试剂作用迅速产生颜色反应。因此，前者又称为间接反应胆红素或间接胆红素，后者称为直接反应胆红素，或直接胆红素。9.TCA循环的要点（要点是调控酶？）1.TCA意义2.TCA具体步骤3.调控机制，也就是调控酶1周期蛋白B和CDK1为MPF的两个亚基，如何证明周期蛋白B和CDK1的结合？用免疫共沉淀法2已克隆了鸡的卵清蛋白的基因，如何让证明在雏鸡的输卵管中该基因不转录，而在产卵母鸡的输卵管中则活跃转录？（northern杂交）