细胞工程植物原生质体培养和体细胞杂交

第十三章植物原生质体培养和体细胞杂交•1960年，英国植物生理学家Cocking首次获得烟草叶片原生质体，酶解细胞壁法。•1971年，Nagata和Takebe首次从烟草叶肉组织的原生质体中诱导出再生植株。•种间或属间甚至科间完成了原生质体融合，并再生为体细胞杂种（somatichybrid）植株。conventionalcrossingprocedurescanberealizedbyprotoplastfusionTheTomatoffel-aproductofintergenerichybridization原生质体培养Protoplastculture•主要目的：实现远缘物种的体细胞杂交。外源染色体、DNA或细胞器导入，创造远缘新种。•流程：原生质体分离原生质体培养体细胞杂交杂种细胞产生愈伤组织再生植株。原生质体：指植物细胞脱去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。原生质体培养：指将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，依据细胞的全能性使其再生细胞壁，进行细胞的分裂分化，并发育成完整植株的过程。第一节植物原生质体培养和体细胞杂交的概念及意义原生质体培养的意义：1．单细胞无性系的建立2．遗传转化的良好受体。3．多种基础研究的实验体系。4．体细胞杂种的形成。体细胞杂交的概念•又称原生质体融合（protoplastfusion）•指在人工控制条件下，不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种的方法。•由融合细胞培养成的植株为体细胞杂种。原生质体自发融合和诱发融合•当细胞壁被溶解后，胞间连丝发生膨大，相邻细胞原生质和细胞器通过膨大的胞间连丝融合形成同核体，实现原生质体的自发融合。仅限于同一物种内。第二节植物原生质体分离细胞壁主要成分：纤维素、半纤维素、果胶质和少量蛋白质等。原生质体分离方法：机械分离法酶解分离法一、原生质体分离-机械分离法方法：利器或机械磨损等，使细胞壁破损，促使原生质体释放。将材料置于高渗糖溶液中预处理，使其发生质壁分离，然后用利刀切割或机械磨损组织，伤口处可以释放出完整的原生质体。只能获得少量原生质体，完整的原生质体更少。一、原生质体分离-酶解分离法可获得大量原生质体。不必发生质壁分离，对活细胞的伤害较轻。常用酶类：纤维素酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶。果胶酶类，包括果胶酶、离析酶。蜗牛酶胼胝质酶主要用于花粉母细胞和四分孢子原生质体分离原生质体二、原生质体的纯化酶液处理后的混合液：完整的未损伤原生质体亚细胞碎屑（叶绿体和微管等）未消化细胞破碎或损伤原生质体等清除这些杂质的过程为原生质体纯化。纯化方法：沉降法漂浮法不连续梯度法沉降法•方法：比重小的等渗溶液中，对酶解物先过滤，再低速离心，使完整的原生质体沉降于管底。•渗透压调节剂：甘露醇。•筛网过滤：除去大的组织碎片和残渣，孔径44~169μm，依原生质体大小来定。•离心：900~4500r/min。漂浮法方法：比重大的等渗溶液，使原生质体漂浮在液体表层。渗透压调节剂：蔗糖。优点：不易受损，成本低。不足：对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体不易漂浮。不连续梯度法采用两种比重不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。叶肉原生质体分离纯化纯化后的叶肉原生质体三、原生质体活力测定原生质体活力关系到细胞壁再生、细胞分裂和分化以及再生植株的形成，反映了原生质体分离和纯化技术的成败。四、影响原生质体数量和活力的因素原生质体培养成功的首要条件是获得大量、完整、有活力的原生质体。影响因素主要有：供试材料、酶的种类和组合及酶解时间、渗透压稳定剂、质膜稳定剂、pH值、光照和温度等。（一）供试材料1.自然生长材料的幼嫩叶片。2.无菌实生苗子叶和下胚轴。3.外植体来源的愈伤组织和细胞悬浮培养物。4.花粉细胞（二）酶的种类、组合和酶解时间•草本植物：2~3种酶混合液。纤维素酶为0.5%~3%，果胶酶为0.1%~1%。•木本植物：纤维素酶同草本，果胶酶更多。•成熟花粉粒和四分体小孢子：除纤维素酶类和果胶酶类外，尚需降解胼胝质层的蜗牛酶和胼胝质酶，浓度为0.5%~2%。(三)渗透压稳定剂常用：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖和盐类等。不同物种原生质体分离时，所需的渗透压稳定剂也不同。原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中更为稳定。较高水平的渗透剂可以阻止原生质体的破裂和出芽，但同时也可能会抑制原生质体的分裂。（四）质膜稳定剂常用：葡聚糖硫酸钾（0.2%~0.3%）MES[2-（N-吗啉）-乙烷磺酸]氯化钙（0.1~1.0M）磷酸二氢钾等。（五）pH值•酶的活性与pH值有关。•低pH值（4.5）：酶活力强，原生质体分离速度快，但原生质体活力差。•pH值偏高：酶活力差，原生质体分离速度慢，完整原生质体数目较多。（六）光照和温度酶的活力与温度也有关系。酶的最适温度是40~50℃。分离原生质体温度：25~30℃。分离原生质体的过程要在黑暗条件下进行：脱壁的原生质体对光非常敏感。第三节植物原生质体培养•过程：一般情况下，原生质体在适宜的培养基和培养条件下经培养2~4d可再生细胞壁，并很快进行细胞分裂，30~60d出现肉眼可见的细胞团，以后细胞继续分裂增殖，几个月后形成愈伤组织或胚状体，最后形成完整的小植株。一、原生质体培养方法类似于单细胞培养。培养方法有三种:液体浅层培养法固体平板培养法双层培养法双层培养法液体-固体双层培养法：将原生质体悬液涂布在固体琼脂培养基表面。固体-固体双层培养法：将原生质体悬液与琼脂混合，涂布在固体琼脂培养基表面。液体浅层培养法方法：将原生质体悬液于培养皿中浅层静止培养。特点：每天轻轻晃动两三次，加强通气。当原生质体经细胞壁再生，并形成细胞团后，应立即转入固体培养基上培养，以利分化形成植株。二、影响原生质体培养的因素原生质体活力原生质体起始密度渗透压稳定剂培养基营养培养条件：光照和温度植物材料和基因型原生质体起始密度•常用：104~105个/ml。•浓度较高：由不同的原生质体形成的细胞团彼此交错生长在一起，形成嵌合体组织。•浓度低于103个/ml：细胞壁再生后，仅分裂1~2次，就无法继续分裂。渗透压稳定剂原生质体是在高渗透压中生长，再生出细胞壁，形成细胞团后，应逐渐降低渗透压，最后转至不含渗透压剂的新鲜培养基中，才能很好地分化。培养基营养原生质体培养常用：MS、B5、NT、N6、MT或它们的衍生培养基。无机盐浓度要低，适当提高Ca2+、Mg2+含量而降低NO3-含量，有助于提高原生质体的稳定性，促进细胞分裂。培养条件光照：培养初期需要黑暗或微弱的散射光。诱导器官发生时，则须强光照。温度：一般为24~30℃，但不同物种间差异比较大。三、原生质体再生过程1、细胞壁再生2、细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成3、植株再生细胞壁再生的过程过程：先是质膜合成细胞壁主要成分微纤维，然后在质膜表面进行聚合作用，生成多片层的结构，以后在质膜和片层结构之间、或在膜上产生小纤维丝，逐渐形成不定向的纤维团，最后形成完整细胞壁。再生壁的成分不同于其来源细胞：主要成分为非纤维素多糖，即葡萄糖占65%，纤维素只占5%。检测新壁合成的方法•主要有：荧光增白剂法和电镜技术。•荧光增白剂是专一性地与细胞壁纤维素的β-葡萄糖苷键特异地结合，因而可以用来检测细胞壁的再生从而确定原生质体活力。•有活力的原生质体经染色后，可在细胞质膜的周围观察到荧光环。2、细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成原生质体细胞壁的存在是进行规则有丝分裂的前提。再生细胞并不一定都能进行细胞有丝分裂。原生质体植板率（分裂频率）变化很大，从0.1%到80%。叶肉原生质体愈伤组织原生质体培养过程中会发生有丝分裂不正常的现象原因：核分裂和胞质分裂的不平衡所致。高浓度的酶处理损伤了质膜，影响质膜形成细胞壁的正常功能。细胞质系统尤其是高尔基体的功能不正常。3、植株再生原生质体培养形成的愈伤组织转移到分化培养基中，可形成不定芽和不定根或形成胚状体结构后直接发育成植株。马铃薯原生质体再生植株四、原生质体培养过程中的遗传变异•适应性变异为非遗传变异，会随着环境条件的改变丧失其变异特征。•遗传性变异能稳定传递给后代，涉及到染色体和基因变异，影响着生物性状的表达。第四节植物体细胞杂交（一）化学融合•化学融合剂：NaNO3高PH-高浓度钙离子聚乙二醇溶菌酶明胶抗体植物凝集素（伴刀豆球蛋白A）聚乙烯醇等。1．NaNO3融合法原理：钠离子能中和原生质体表面的负电荷，使凝聚的原生质体的质膜紧密接触，促进细胞融合。融合率为0.1%~4%。2．高pH-高浓度钙离子融合法原理：钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，促使原生质体膜的结合，而高pH又能改变质膜的表面电荷，从而有利于细胞融合。融合率为10%左右。钙离子浓度和pH值范围因植物种类的不同而不同。高pH-高浓度钙离子融合方法（烟草）a.两亲本原生质体混合（1：1）；b.离心使原生质体沉集在一起；c.去上清液，加入2ml融合液（50mmol/LCaCl2·H2O+400mmol/L甘露醇，pH10.5）；d.离心使原生质体沉积，于37℃中水浴30min；e.用清洗介质（甘露醇，CaCl2·H2O）置换融合液，放置30minf.用清洗介质洗2次，培养。原生质体电融合Fusionprotoplast（一）杂种细胞的选择方法：互补选择法和机械选择法1．互补选择法利用两个亲本具有不同的遗传或生理特性，在特定的培养条件下，只有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。2．机械选择法二、体细胞杂种选择系统（自学）（二）杂种植株的鉴定杂种细胞的筛选只能是体细胞杂种真实性的间接证据。融合后某一亲本染色体的丢失和突变、细胞器的丢失、分离和培养过程中可能发生的体细胞变异等都会影响杂种植株的最终获得。四、植物细胞质工程（一）细胞质杂种（二）细胞器移植（叶绿体和细胞核）（三）微生物移植（固氮菌和绿蓝藻）（四）外源DNA的摄入主要内容1.何谓原生质体、原生质体培养、体细胞杂交？2.植物原生质体的分离和培养有那些主要步骤？它在遗传操作中有何重要意义？3.影响原生质体培养的因素有什么？如何获得大量的、有活力的原生质体？