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抗血栓药氯吡格雷的化学酶合成方法摘要：L-邻氯苯甘氨酸经确认是已知的抗血栓药氯吡格雷中结构的一部分。我们准备通过酶催化光学纯手性砌块拆分邻氯苯甘氯酸甲酯。最好的结果就是通过固定化枯草杆菌蛋白酶,酶交联聚合获得碱性蛋白酶。高的对映体过量合成子保持不变的氯吡格雷合成，简单的过程使这个途径适合大规模生产。1．介绍氯吡格雷是一种抗血小板聚集和抗血栓形成的药物，减少动脉粥样硬化事件的管理包括心肌梗死、缺血性中风和周围性血管疾病,广泛用于血管内支架布局后结合阿司匹林。在两个可能的立体异构体中,只有(S)型对映体适用于制药应用中,因为(R)型对映体是缺乏抗血栓形成的活性,并在实验中导致动物抽搐。邻氯苯甘氨酸（S）型是一个非天然的氨基酸且在市场上销售的外消旋混合物，是一种有价值的合成氯吡格雷的中间体，立体中心与取代基的两个分子严格相关。几种(S)型的合成法来自于解决拆分(RS)邻氯苯甘氨酸,或其酯类,通过与酒石酸的形成非对映的盐或樟脑磺酸分步结晶。另外，准备工作在经济上更不合适,因为50%的最终产品必须被丢弃，推迟这项拆分到最后一步,也就是说,结晶(RS)氯吡格雷与(1R)樟脑磺酸,或其前体与(2R,3R)酒石酸的结晶推迟。苯甲基的质子的存在使得芳基甘氨酰胺外消旋化倾向:温和的条件和酶的立体选择性转换促使我们尝试生物催化的方法以便获得光学纯的邻氯苯甘氨酸与所需的结构。虽然很多成功的例子关于酶催化苯基甘氨酸已经在文献上报道，只有少数关于邻氯苯甘氨酸的案例被描述。苯基甘氨酸和一些类似物,不同的取代芳环,包括邻氯苯甘氨酸可作为半合成青霉素和头孢菌素的原料，已经准备采用D乙内酰脲酶。(RS)型邻氯苯甘氨酸已经成功地被Fadnavis等人通过固定化青霉素G酰基酰化酶解决。2．结果与讨论2.1酶催化RS型邻氯苯甘氨酸的拆分首先,我们计划去探讨生物阴极转换羧基或氨基的可能性,即酶催化水解或合成酯3和酰胺4。表1酶法水解(RS)31.高效液相色谱法计算。2.酸的结构得到光学纯的分配与高效液相色谱法相比(S)2和(S)3(见下文)。3.(S)结构属于未反应的酯3。方案1：枯草杆菌蛋白酶水解(RS)6。表2酶法水解(RS)61.由高效液相色谱C18固定相而定。2.由叔丁氧羰基切除后高效液相色谱手性固定相而定。3.酸5的结构被指定,与文献的D值相比，6被酯化。我们从脂肪酶筛选开始,同时考虑到稳定的性能、选择性和可大规模生产的工业效用。然而,尽管宽类底物的选择性,包括氨基酸,只有低ee(0-25%)后得到邻氯苯甘氨酸甲酯3水解,从不同的起源利用脂肪酶。(从猪胰脂肪酶,PPL,从假单胞菌发射光谱,PFL,从圆柱假丝酵母,从南极假丝酵母,CALB)添加一个离子液体1-丁基3-甲基咪唑四氟硼酸盐，选择苯基甘氨酸,并没有提高对映体纯度。在其他的水解酶中,只有胰凝乳蛋白酶提供一个满意结果。酸(S)2ee停滞在40%~67%,当改进反应条件时,状况却得不到改善。一家韩国集团最近获得一项专利用碱性蛋白酶催化解决邻氯苯甘氨酸甲酯,但是,枯草杆菌蛋白酶(从枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或嘉士伯方案1),在我们的手中,只提供部分浓缩(S)3(23-27%ee)。值得注意的是,在这种情况下,普遍(S)异构体是未反应的酯。(见表1,条目10,11)。这个事实可以解释的观测报告,枯草杆菌蛋白酶的催化部位排向脂肪酶的催化的镜像站点。CALA和B可以酰化(RS)邻氯苯甘氨酸甲酯3到4a或4b在有机溶剂中,但是,正如报告中苯基甘氨酸甲酯随着PPL和PFL，他们的行动是没有选择性的。从蜂蜜曲霉酰基转移酶,到链霉菌属不能识别N乙酰衍生物作为衬底，N三氟乙酰基由4变成2，收益率变低（24小时后变为10%),没有立体选择性。这些初步结果促使我们处理甲酯筛选,选择容易移动的(TFA治疗)逆转录酶叔丁基羰基组。从脂酶检测,只有PPL显示非常低的活动,改变叔丁氧羰基甲酯，由6到5羧酸收益变低。胰凝乳蛋白酶,这是一个更有前途的酶，在无保护的情况下甲酯3没有改变叔丁氧羰基衍生物6，甚至在4天之后。方案2试剂与条件：(i)CH3OH,DCC,DMAP,CH2Cl2;(ii)TFA,CH2Cl2;(iii)20%NH4OH;(iv)TsCl,(iPr)2O,Et3N;(v)NaHCO3,KI,CH3CN;(vi)paraformaldehyde,ClCH2CH2Cl,HClinDMF表3高效液相色谱条件1.检测器波长对所有化合物被设定在220纳米,除了9(250纳米)。2.流量为1毫升/分钟,除了9(0.7毫升/分钟)。3.每个样本注入的10微升。这些令人满意结果与Arosio等人报道的详细研究蛋白酶催化水解的一系列硫代酸酯相一致。用以代替carboxyester的ethylthioester,被作者选自适合完成衬底通过原位催化基础继续(R)异构体的外消旋化。使用难闻气味己二硫醇l被认为不适合大规模制备的目的,另一方面,考虑到(RS)邻氯苯甘氨酸的低成本对最终产品的价值，完成去消旋化过程不是强制性的,在任何情况下(R)异构体可能后来外消旋和回收。由于氯吡格雷的合成需要(S)甲基酯而不是(S)酸，我们设法使用枯草杆菌蛋白酶嘉士伯作为生物催化剂在相反的反应,也就是说,酸5的酯化。事实上,在这种情况下,由于酶(S)异构选择,(S)酯6需要被获得。几个有关枯草杆菌蛋白酶催化酯化的氨基酸或peptideshave例子被报道,但在我们的示例中只有起始物料在所有条件下测试时被发现。由于这些结果可能是由于甲醇的负面影响,我们尝试使用一个已知的酶,更稳定的枯草杆菌蛋白酶制剂,交叉连接酶聚合商商品化（诺维信）被称为Alcalase。然而在这种情况下没有观察到5到6的酯化。然而,枯草杆菌蛋白酶提供的实验优点促使我们测验这个酶水解条件下的制备。从有机溶剂的研究中，四氢呋喃提供了最好的结果ee(98%),而在乙腈和二甲基甲酰胺ee分别只有79%和65%。使用交联酶在四氢呋喃/水也缩短了反应时间,所需的40%的变成了(S)酸5在14小时后实现,而不是自由枯草杆菌蛋白酶在叔丁基甲基醚/水中所需的63小时。(S)型异构体5通过酯化反应移除保护基(TFA)而使用(S)甲基酯3(90%的收益率),氯吡格雷制备的合成子被转化。2.2由（s）型邻氯苯甘氨酸合成氯吡格雷从报道的氯吡格雷的合成提供四氢吡啶一部分形成作为第一步,紧随其后的是引入合适的氯苯衍生品，另外,四氢吡啶成环反应后在衍生苯硫酚乙醇7和8或9甲酯(RS)3中,我们选择了第二种方法制备光学纯化学酶促精制(S)3并处理,沿袭文献的方法描述(RS)3、9在乙腈与甲苯磺酸盐8的碳酸氢钠提供中间9(70%)。最好的结果(50%的收益率)杂环形成了与多聚甲醛(作为甲醛来源)福尔马林或1、3二氧戊环提供较低的收益率和更复杂的最终反应混合物(方案2)。(S)1的ee由手性柱高效液相色谱分析。2.3高效液相色谱分析在邻氯苯甘氨酸无保护的案例中，酶促反应的进展可以现场实时监控，使用手性柱。叔丁氧羰基衍生品的案例中,一个手性柱筛选同时执行两个监控有难度。我们因此决定通过C18柱控制反应进程,搁置ee评估到移除叔丁氧羰基团之后。这样我们不仅能够检测生物转化的立体化学的结果，而且验证了一些外消旋化是否最终发生在去保护步骤。由于已知硫代酸酯主要为外消旋化，所以我们不仅要检测ee的最终产物1，还要检测所有的中间产物。实际上，我们尝试着将(s)-3作为自由基（作为甲苯磺酸盐8的亲核取代）从三氟醋酸盐中移除BOC，使用0.5M的碳酸氢钠反应生成10%的R型同分异构体。相反的，当与20%氢氧化铵反应时，没有观察到外消旋化。通过使用手型固定相，中间产物9和最终产物1的光学纯度就都可以确定。选择列,移动阶段,收集和保留时间收录在表3。3.结论光学纯的氯吡格雷,一种结构为蛋白氨基酸即(S)型邻氯苯甘氨酸的抗血栓药物,32%的收益来自于邻氯苯甘氨酸甲基酯。这种手性合成子通过化学酶法来获得,是由于苯甲基的质子的存在。为了避免频繁的对硫代酸酯进行外消旋化，通过立体选择容易获得的蛋白酶催化水解(RS)6观察到了最好的结果。使用交联聚合的枯草杆菌蛋白酶(碱性蛋白酶),而不是一个游离酶,不仅简化了实验过程和酶的复苏,相比于类似的对映体过量，也明显缩短了反应时间(14小时而不是63小时)。为了评估所有中间体对映体纯度,高效液相色谱法在对于每个化合物的手性固定相的研究更方便。流程中的良好产率,氯吡格雷和枯草杆菌蛋白酶的工业效益以及酶催化的有效性使这个合成途径适合大规模生产，而为了避免冗长且费时的分步结晶非对映的刺激过程,通常用于S型异构体的案例。4.实验4.1.综述所有的试剂和酶是从Sigma-Aldrich购买的。所有反应都使用薄层色谱法，在60，F254的硅胶预涂板以及110摄氏度下的三酮溶液里被观测(0.3g的丁醇，100ml和3ml醋酸)。TLC洗涤液是由水、丁醇、乙酸(5:4:1)混合,剧烈搅拌后的有机相分离,。在60(0.063--0.200毫米)(默克公司)的硅胶上用柱层析法进行。用Bruker-Avance500MHz光谱仪记录核磁共振波谱。在25摄氏度时可以用Perkin–Elmer241旋光计测定1分米的细胞旋光度。用高效液相色谱法分析Merck-Hitachil-6200。质谱被记录在一个热电FinniganLCQTM离子阱质谱仪上。使用Perkin–ElmerDSC-7仪器进行差示扫描量热法(DSC)。4.2N-Boc（RS）邻氯苯甘氨酸5向在50ml水中邻氯苯甘氨酸(10g，0.054mol)的悬浮液中添加1，4二恶烷(40ml)和氢氧化钠(2.37g,2.37mol)。在添加乙酸叔丁酯碳酸氢钠(12.4mol,0.054mol)之后,将混合物在室温下搅拌18小时。在薄层色谱监测反应的进展。浓缩混合物在换算压力,增加了1M盐酸直到pH值变为3。通过抽吸获得了沉淀产品(13.7g,89%的收率)。核磁共振氢谱表征为(CDCl3)d1.23(s,9H,CH3C),5.75(d,1H,CH,J4.5Hz),7.22–7.34(m,2H,Ar),7.41(d,1H,Ar,J6.5Hz),7.51(d,1H,Ar,J6.9Hz),8.23(d,1H,NH,J4.5Hz)。4.3.N-Boc-(RS)邻氯苯甘氨酸甲酯6向80ml干燥的二氯甲烷的化合物5(3g、10.5mmol)的溶液中按顺序添加80ml的无水甲醇DCC(2.38g,2.38mmol)和DMAP(0.12g,1.05mmol)。在室温下搅拌反应混合物2小时。利用薄层色谱监测酯的形成。白色沉淀被吸入，用pH值8(2*20毫升)的碳酸氢钠溶液洗涤滤液,用硫酸钠处理干燥然后减压蒸发。用硅胶柱层析法纯化残留物(1/10)提供纯的6(洗涤液己烷/乙酸乙酯98:2,2.7g,86%)。核磁共振氢谱表征为(CD3OD)d1.47(s,9H,CH3C),3.74(s,3H,CH3O),5.73(brs,1H,CH),7.30–7.38(m,2H,Ar),7.43(m,1H,Ar),7.50(m,1H,Ar)。4.4.N-Boc(S)邻氯苯甘氨酸54.4.1.枯草杆菌蛋白酶催化水解(RS)邻氯苯甘氨酸6向TBME(18ml)的(RS)型6(1g，3.34mmol)的溶液中添加pH值7.5的缓冲剂(0.1MKH2PO4/0.1M氢氧化钠50ml/40.9ml)(36ml)和蛋白酶从地衣芽b(24毫克,255U)。通过添加0.5M的氢氧化钠并且不停地搅拌保持温度在35度,pH值维持在7.5。反应过程由高效液相色谱监测(见表3)。制备高效液相色谱分析的样品如下:一些水和有机相,20和10个,分别被收集后,通过氮气气流移除叔丁基甲醚。加入甲醇之后,通过0.45lmGHPACRODISC过滤掉混合物，对滤液进行了分析。转换了40%后(65小时)pH值是8并且将水相从有机分离后,提取到叔丁基甲醚(515ml)。在ph为3时提取出水相与叔丁基甲醚,用硫酸钠干燥,用(S)-酸5(0.33g,