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色谱法概论容蓉13869196006课件下载：jhq@sdutcm.edu.cn405405第一节概述一、色谱法(Chromatography)的发展一些经典的分离方法：沉淀、蒸馏和萃取现代分析中，大量采用色谱和电泳分离方法。迄今为止，色谱方法是最为有效的分离手段！其应用涉及每个科学领域。历史：1903年，俄国植物学家MikhailTswett最先发明。植物色素分离见图示色谱法的发展历史年代发明者发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念。1931Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。1938Izmailov,Shraiber最先使用薄层色谱法。1938Taylor,Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。1941Martin,Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1944Consden等发明了纸色谱。1949Macllean在氧化铝中加入淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段。1952Martin,James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。1956VanDeemter等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1959Porath,Flodin发表凝胶过滤色谱的报告。1964Moore发明凝胶渗透色谱。1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981Jorgenson等创立了毛细管电泳法。早期的色谱技术只是一种分离技术而已，与萃取、蒸馏等分离技术不同的是其分离效率高得多。当这种高效的分离技术与各种灵敏的检测技术结合在一起后，才使得色谱技术成为最重要的一种分析方法，几乎可以分析所有已知物质，在所有学科领域都得到了广泛的应用。色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作年代获奖学科获奖研究工作1937化学类胡萝卜素化学，维生素A和B1938化学类胡萝卜素化学1939化学聚甲烯和高萜烯化学1950生理学、医学性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离1951化学超铀元素的发现1955化学脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素1958化学胰岛素的结构1961化学光合作用时发生的化学反应的确认1970生理学、医学关于神经元触处迁移物质的研究1970化学糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物中的作用1972化学核糖核酸化学酶结构的研究1972生理学、医学抗体结构的研究方法项目数量1985年版1990年版1995年版2000年版2005年版HPLC鉴别及含测7811916971327TLC鉴别及含测1568GC鉴别及含测47高效液相色谱的样品芬达橙汁汽水水甜味剂人工香精(香橙)人工色素(柠檬黄)高效液相色谱-组分分离芬达样品色谱图水甜味剂人工香精(香橙)人工色素(柠檬黄)高效液相系统液体传输液体样品高效液相系统高效液相色谱柱数据处理检测器检测器硅胶填料液体医药样品结果高效液相色谱柱可更换卡套色谱柱Agilent1100高效液相系统溶剂以不同速率流出的组分色谱图高效液相系统和色谱柱气相-质谱系统色谱柱气相色谱系统检测器进样器色谱柱GAS气源柱温箱数据处理生命科学奥运会医药工业FBI法医，法检0123(minutes)气相色谱分析实例体液和组织中的药品血醇水平药品纯度色谱分析领域(1)食品与香料分析实例食品中的天然香精香料人工香精香料饮料中的醇类010203040Time(min.)奶酪胆固醇pepperoni多肽蘑菇醛酸消化物样品:比萨色谱分析领域(2)石化DB-1,15mx0.25mmI.D.0.25µmfilmStegosaurus-o-gram航天汽油空气质量标准Pew!!分析实例燃料油定级汽车排放的废气色谱分析领域(3)环境DB-502.2105mx0.53mmI.D.,30µm气相分析实例水和土壤中的农残饮用水中的溶解物(MTBE甲基叔丁基醚)工业污染物新型持久性有机污染物（PCBs多氯联苯,PFCs全氟有机物）色谱分析领域(4)NamLaketinTibat纳木错PFCsLiver180~680ng/gBlood26~52ng/gPlasma2580ng/mlPFCs二、色谱法的几个重要术语*1.色谱柱（column）在茨威特实验中,装有CaCO3的玻璃管,即是一根色谱柱(是指包括CaCO3的管).2.固定相(stationaryphase)在柱内固定不动的一相称固定相,如CaCO3.3.流动相(mobilephase)在柱内不断流动的一相,称流动相,如石油醚.4.被分离组分（样品）如色素5.洗脱将流动相连续不断地加入色谱柱,使之通过固定相,把被分离的物质冲洗出柱的过程,叫洗脱。洗脱是色谱过程中必要而又重要的步骤—选择适宜的流动相、固定相实现分离。6.洗脱剂在洗脱过程中加入色谱柱的流动相即洗脱剂。7.洗脱液(流出液)流出色谱柱的溶液,即洗脱液。三、色谱法分类1．按两相分子的聚集状态分：流动相固定相类型液相色谱液体固体液-固色谱液体液体液-液色谱气体固体气-固色谱气体液体气-液色谱气相色谱续前2．按分离机制分：吸附色谱：利用物理吸附性能的差异分配色谱：利用分配系数的不同键合相色谱：采用化学键合固定相空间排阻色谱：利用排阻作用力的不同离子交换色谱：利用离子交换原理毛细管电泳：带电组分在电场中电泳淌度的差异毛细管电色谱：电泳与色谱分离机理相结合续前3．按固定相的固定方式分：平面色谱纸色谱薄层色谱高分子薄膜色谱柱色谱填充柱色谱毛细管柱色谱4.按使用目的分类分析用：实验室、便携式；分析样品量少制备用：实验室用、工业用；纯物质制备，如高纯试剂、蛋白质、手性药物拆分和纯化流程用：工业生产流程在线连续使用第二节色谱过程与术语分离任何物质都要依据它们性质的差异。例如蒸馏是利用沸点的差异，沉淀、结晶是利用溶解度不同。在色谱当中，是利用物质在两相中溶解、亲和、吸附或其它亲和作用力的不同，使混合物中各组分达到了分离。例如：分离含A、B两种组分的混合溶液。一、色谱分离依据简介当组分进入柱后，由于组分与固定相间的亲合力，就要被固定相所滞留，即固定相对组分有滞留作用（保留作用），组分的性质不同，则固定相对不同组分的滞留能力（保留能力）不同。组分与固定相之间的亲合力越大，则固定相对该组分的滞留越强烈。它随流动相移动的速度就较慢；反之，组分在柱内的移动速度快；从而造成了A、B在柱内的差速迁移，即移动速度不同。当经过一段距离后，速度的差异造成A、B组分先后出柱，得到分离。这就是色谱过程的本质。掌握的要点：（1）组分在柱内随流动相不断移动（溶解于流动相）。（2）固定相与组分有亲合能力，即对组分有滞留能力（保留能力），使组分的速度低于流动相速度。（3）性质不同的组分与固定相亲合力不同，固定相对其滞留能力（保留能力）不同，造成迁移速度不同（差速迁移）。（4）经过一定柱长后，各组分因速度差异而分开，即需要一定的柱长。二、色谱流出曲线（色谱图）所谓色谱流出曲线，即流出液中的组分浓度随洗脱体积或洗脱时间的变化曲线，也称色谱图。获得：（1）间隔一定时间或一定流出体积，测定流出液中组分的浓度，以浓度（检测信号）为纵坐标，时间或体积为横坐标，描点作图即得（2）在柱子出口处设置检测器，如测定流出液的吸光度，换算成浓度（信号值），连续记录流出液的检测信号随时间的变化，即得色谱图（仪器化）。流出曲线是柱内组分分离结果的反映，是研究色谱分离过程机理的依据，也是定性、定量的依据。色谱流出曲线的意义：色谱峰数=样品中单组分的最少个数；色谱保留值——定性依据；色谱峰高或面积——定量依据；色谱峰宽或区域宽度——色谱柱分离效能评价指标；色谱峰间距——固定相或流动相选择是否合适的依据。三、几个重要的色谱参数及概念（1）基线：在实验条件下，当只有流动相通过（检测器）色谱柱时，得到的流出曲线，通常为一水平直线称为基线。（2）峰高（h）：从色谱峰到基线的垂直距离。（3）峰宽（Wb）：从色谱峰的捌点作切线，与基线两交点之间的距离，也称基线宽度。（4）半峰宽（W1/2）：色谱峰高一半处峰的宽度（不是峰宽的一半）（5）标准偏差（σ）：色谱峰两侧两捌点之间的距离的一半，也即0.607h处的峰宽的一半。Wｂ、σ、W1/2色谱意义：它们反映被分离的组分分子在柱内迁移时的离散程度,Wｂ、σ、W1/2越小，表示分子相对集中；Wｂ、σ、W1/2越大,表示分子相对分散。（6）拖尾因子T:0.95～1.05，色谱峰为对称峰ABAAWTh2205.0（7）保留时间(tR)（Retentiontime）流动相携带组分通过柱子所需要的时间，即从进样洗脱到流出液中组分的浓度出现极大值点所需要的时间。（8）死时间(t0)不被固定相所滞留的组分通过色谱柱所用的时间，即不被固定相所滞留的组分的保留时间，即死时间。在时间上，它等于流动相分子通过色谱柱所需的时间，当某组分不被固定相所滞留时，即完全随流动相移动，其移动速度完全等于流动相的速度，所以t0=tm。（9）调整保留时间(tR’)：扣除死时间后的组分实际被固定相所保留的时间,即tR’=tR-t0=tR-tm意义：组分随流动相移动的时间都是相同的，都是死时间。它与固定相、组分的性质均无关，只与流动相的流动速度有关，对分离不起作用。tR’即为组分在固定相中出现的（保留的）时间，即组分被固定相所滞留的时间，与组分和固定相之间的作用力有关。tR’是与组分和固定相性质有关的，更能从本质上反映出不同组分的差异，反映色谱过程的实质。（10）保留体积（VR）从进样开始到组分洗脱出柱所用的洗脱剂的体积（与流速无关）。（11）死体积（V0、Vm）不被固定相滞留的组分的保留体积(或不被固定相滞留的组分流出色谱柱所需要的洗脱剂的体积)。这个体积应等于柱内流动相的体积，即流动相的量，也即固定相之间的空隙。（12）调整保留体积（VR’）VR’=VR-V0=VR-VM（13）相对保留值（α2,1，γ2,1）以一已知物的调整保留值为基准，其它各组分的调整保留值与之比值即为α2,1，γ2,1。α2,1=tR2’/tR1’=VR2’/VR1’=γ2,1须注意：①规定对于α2,1须有tR2’tR1’VR2’VR1’即α2,11。②对于γ2,1,“1”表示基准物质,“2”表示待测物质,用于定性分析。③相对保留值只与固定相、组分及流动相的性质有关,与柱长、流速等无关。④若两组分能分离,则α2,11⑤α2,1又称为选择性因子（14）柱长(L)柱中填充固定相部分的长度。要点：①需掌握tR、VR、t0(tm)、tR’、VR’的色谱学意义及定义。②这些参数之间的关系，它们能说明什么问题?思考题：若一组分的分子通过色谱柱需tR时间，流动相分子通过色谱柱需用t0时间，问：该组分分子在色谱柱内有多少时间停留在固定相上，有多少时间流动相中？图示固定相——CaCO3颗粒流动相——石油醚色带*&第三节色谱法基本原理色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。一、色谱法分离过程的动力学观点所谓动力学观点是以分子的运动速度来考虑问题，研究的是状态随时间的变化率。1、组分在色谱柱内的移动速度（绝对速度）被分离的组分以一定的速度随流动相迁移。当