纳豆激酶发酵培养基的优化

纳豆激酶发酵培养基的优化姓名:黄江坤班级：制药132学号：201304040225纳豆激酶发酵培养基的优化一、菌种选择选用纳豆枯草杆菌为发酵菌种二、纳豆菌的特性纳豆菌，通常为（0.7-0.8）um×(2.0-3.0)um,革兰氏阳性。生长在葡萄糖琼脂的细胞原生质染色均匀。芽孢椭圆形或柱状，中生或偏中生，即使孢囊膨大，也不显著，有鞭毛，能运动。生长温度最高为45-55℃，最低为5-20℃。孢子耐热性强。三、纳豆激酶基因的表达NK基因起始密码子为GTG,其上游1b7p处为核糖体结合位点AAAGGAG,SD序列上游为刀T含量高达2%的转录调控区域,1143bp的阅读框架编码29个氨基酸的信号肚,77个氨基酸的前导肽及275个氨基酸的成熟肽。结构基因的3末端为连续3个终止密码子TAA、TAG、TAA,终止密码子之后一段序列可形成茎环结构,即因子非依赖性终止顺序。NK的最初产物是381氨基酸的蛋白前体。其中N端的1一23氨基酸残基是信号肽,24一106氨基酸残基是前导肽。蛋白前体切除N端的106个氨基酸残基成为275氨基酸残基的成熟纳豆激酶;而去掉信号肽的产物(含前导肽和成熟肽)称为纳豆激酶酶原。信号肽包含一个带3个正电荷的亲水氮端以及一段不带电荷的疏水残基序列,其功能是使NK正常分泌出胞外,其切割位点位于Ala一Glu一Aal保守序列之后。信号肽与成熟肽之间具有的前导肽具有帮助NK正常折叠形成活性构象的功能,目前己发现一些与NK基因同源的枯草杆菌素蛋白及链激酶有与此相似的前肽区域。四、纳豆激酶的蛋白质结构及生化性质：纳豆激酶（NK）是一种丝氨酸蛋白酶，由275个氨基酸组成的单链多肽结构。NK肽链无二硫键,活性中心在Asp32,His64和Ser221,与底物结合部位在Serl25,Lenl26和Glyl27处。NK与大多数枯草杆菌蛋白酶在核苷酸序列上和肽链链氨基酸组成上具有高度同源性,它与B.subtilis1168产生的枯草杆菌蛋白酶E仅有13个核苷酸不同,在肽链组成上仅有2个氨基酸不同,它们成熟肽链一级结构的相同性为99.5%;纳豆激酶等电点为pH8.6,纳豆激酶在pH6.0一12.0范围内稳定,pH低于5.0则不稳定。40℃保温30mni活力无变化,温度超过50℃,活力逐渐丧失,超过60℃时则因蛋白变性而迅速失活,反复融冻对酶活影响不大。五、以普通发酵培养基为基础培养基，分别改变培养基的组成和含量考察培养基组成对纳豆芽孢杆菌液体发酵产纳豆激酶活力的影响1氮源纳豆激酶是种诱导酶，菌株分泌纳豆激酶的目的是利用它水解环境中的蛋白质及肽类,以提供自身生长所需的氨基酸。通过比较大豆蛋白胨、豆渣、豆浆和胰蛋白胨对产酶的影响,结果发现大豆蛋白胨最佳,豆渣和豆浆次之,而胰蛋白胨几乎不产纳豆激酶。而且还发现在大豆蛋白胨中存在诱导菌体分泌纳豆激酶的前体。2碳源目前在碳源优化研究中,已考察的碳源包括木糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖和淀粉,一般结论是木糖为最优。其中,用葡萄糖作碳源时菌株产酶比较快,但产酶不多。这可能是葡萄糖代谢阻遏造成的,也可能与纳豆激酶表达启动子的性质有关。3发酵液pH发酵液的pH会影响菌体对基质的利用速度、细胞形态结构及细胞内外各种酶的活性,从而影响菌体的生长和产物的合成。各种菌株都有自己适宜的生长和产物合成的pH范围,而且这两者间还可能不同,因此要把发酵液pH值控制在需要的范围内。而在发酵过程中,随着碳源的利用,发酵液pH有下降的趋势;同时胰蛋白胨被水解生成铵离子又会使pH上升,因此需要加入缓冲体系以控制发酵液pH。所以选用NaH2PO4—Na2HPO4缓冲体系,除了这种体系简单易得,缓冲能力适宜外,还考虑到磷是核酸和蛋白质的必要成分,也是重要的能量传递者一三磷酸腺普(ATP)的成分;而且磷有利于糖代谢的进行,能促进微生物的生长繁殖。但研究中发现过量的磷也会抑制许多产物的合成。4无机盐离子镁离子是许多重要酶的激活剂,还能影响蛋白质的合成;同时镁离子对纳豆激酶稳定性有利。而硫是含硫氨基酸的组成部分,纳豆激酶恰好具有含硫氨基酸。因此在培养基中加入了一定量的MgSO。钙离子对纳豆激酶也有促进酶活稳定的作用,所以还加入了CaCl2。但应该注意的是,MgHPO4和CaHPO4都是难溶物质。因此在配制培养基时应注意各组份添加顺序,避免产生沉淀、影响缓冲体系的缓冲能力。在本研究配制培养基时,先取水溶解胰蛋白陈和木糖,然后加入NaH2PO4，Na2HPO4,最后边搅拌边加入MgSO和GaC12,较好的避免了沉淀的产生。5酶稳定剂当与血清蛋白、胃粘液蛋白以及煮沸过的小麦或大米提取液和肉汤混合后,纳豆激酶的稳定性显著增加,甚至在酸性条件下,酶活性也不会完全丧失。这说明纳豆激酶在胃环境中能保持一定的活性,可食用纳豆达到溶栓目的。还有研究发现,K+、Fe2+对酶稳定性无明显影响,而Zn2+、Co2+、A13+、Ca2+和Mn2+等则表现出不同程度的抑制作用,Hg2+可使纳豆激酶完全失活,Mg2+和Co2+对酶有明显激活作用。因此，可以选用大豆蛋白胨为氮源，木糖为碳源，NaH2PO4—Na2HPO4MgSOCaCl2为无机离子，煮沸的小麦提取液为酶稳定剂在pH在7—8条件下对基础培养基进行优化来获得优化的纳豆激酶发酵培养基。青霉素发酵培养基的优化姓名:王俊班级：制药131学号：201304040130