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线虫的EMS诱变和突变体筛选摘要：秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans，C.elegans）是一种被广泛研究的模式生物，其性状容易辨别，突变型多且容易获得。本实验用EMS诱变剂对同步化后的N2型怀卵成虫线虫进行不定向诱变，筛选出一系列的突变体，再通过对亲代突变体的子代进行进一步的筛选，筛选出F1、F2、F3突变体，最后获得性状稳定的、能够稳定遗传的突变体，可以将突变体至于-80℃保存。本次试验涉及到的生物技术有：无菌操作技术，同步化技术，EMS诱变技术，显微操作技术等。将获得的突变体与野生型作对比，可以在显微镜下观察到性状明显的突变体，将突变体转移、传代、保留，最后获得稳定的突变体。关键词：秀丽隐杆线虫同步化EMS诱变无菌操作技术突变体1.引言秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans，C.elegans）是一种以细菌为食，居住在土壤中，无毒无害、可以独立生存的线虫。它有如下几个特点：①其个体小，成体仅1mm长，雌雄同体全身共有959个细胞，雄性线虫全身共有1031个体细胞；②为雌雄同体：雄性个体仅占群体的0.2%，可自体受精或双性生殖；③染色体组简单：只有5对常染色体和1对性染色体；④基因组便于研究：基因组大小仅为100Mb，并且内含子少，基因密度高；⑤生活周期短且随温度变化：线虫整个的生命周期仅3天（25℃）。野生型线虫胚胎发育中细胞分裂和细胞系的形成具有高度的程序性，这样就便于对其发育进行遗传学分析。温度越高，生活周期越短；⑥有大量突变株；⑦繁殖能力强：成虫一生可产300个受精卵；⑧易于保存：可以用-80℃冰箱长期保存线虫作为模式生物，与酵母、果蝇、斑马鱼、小鼠和拟南芥等一起，为生命科学的发展做出了极大的贡献。它与其他模式生物相比，有自身优势，如：①它只有消化系统和呼吸系统，并且肉眼可见，容易研究；②它是目前最适合大规模药物筛选的多细胞动物，③它的研究成本低：既提供了一个完整动物实验系统，又避免了小鼠模型的高价费时等。但也有其缺点，如：①线虫的神经元细胞对RNAi不敏感；②线虫没有心脏、获得性免疫系统、呼吸系统等，所以一些人类疾病无法在线虫中模拟；③鉴于线虫与人类种间距离太远，线虫的作用仍是在药物研发初期，快速粗筛，提供线索，需要再经过哺乳动物模型的“细筛”。基于线虫的自身体积小并且结构简单的优势，国内外众多的科研机构都在以线虫作为研究材料，在RNAi、衰老、药物筛选、功能基因组学等领域进行研究。研究发现，线虫中大约有35%的基因是在人体中具有等同作用，并且有大量人类遗传疾病同源基因，只有大约58%是线虫特有的，所以，从理论上讲,只要人类疾病的靶蛋白或调控途径是物种间保守的,就可能利用模式生物来进行研究。目前，已经有许多成功的线虫病理模型，如：溶酶体病，阿尔茨海默症(Alzheimer’s,AD)，多囊肾病(polycystickidneydisease)，Duchenne肌营养不良症，过氧化物体生物合成缺陷等。甲基磺酸乙酯，简称EMS，是一种重要的致癌物之一，生物学上可以用来创建突变体库。本实验就是将EMS作为诱变剂来获得线虫的突变体。线虫有单基因突变形成的表型，例如：运动不协调（uncoordianated，Unc）、短胖（dumpy，Dpy）、打卷（roller，Rol）等，造成这些表型的基因有很多个，分别分布于各条染色体上。这些易于观察的表型作为遗传标记，给线虫的经典遗传学实验带来了极大的便利。此外，线虫还有许多组织特异性标记的品系，如在线虫中负责协调前后运动的D型运动神经元。我们通过对排卵时期的线虫进行诱变，观察诱变后线虫突变体表形，对突变体后代进行筛选，探究影响突变型基因的显隐性，最终获得能够稳定遗传的突变体。2.材料和方法2.1材料、试剂和器材实验材料：N2型秀丽隐杆线虫。实验试剂：NGM（NematodeGrowthMedia）固体培养基、LB液体培养基、M9线虫生理溶液。实验器材：培养皿、报纸、锥形瓶（500ml、300ml、100ml）、15ml离心管、蓝枪尖、黄枪尖、Ep管、5ml的塑料试管、高压蒸汽灭菌锅、离心机、酒精灯、移液枪（1000ml、200ml）。2.2方法2.2.1仪器的洗涤、包装与灭菌，相关溶液的配制。（1）仪器的洗涤与包装①用自来水洗涤55mm培养皿（我们组一次性洗12个培养皿），晾干后用报纸包装好，以待灭菌。②洗涤500ml锥形瓶，300ml锥形瓶，100ml锥形瓶，15ml离心管若干，锥形瓶装入液体后，用锡纸封口，15ml离心管用报纸包好，以待灭菌。③将蓝枪尖和黄枪尖塞入枪尖盒，用报纸包装好以待灭菌。④将Ep管和5ml的塑料试管管放入玻璃瓶中，用报纸封口，以待灭菌。（2）相关溶液的配制①NGM（NematodeGrowthMedia）固体培养基的配置按表1配置NGM固体培养基表1NGM固体培养基的配方NGM固体培养基150ml400mlNaCl0.45g1.2gagar2.6g6.8gtyptone0.375g1.000gdH2O146ml390ml120℃灭菌15分钟，然后在无菌的条件下加入下列灭菌的溶液CaCl2(1M)0.15ml0.40mlMgSO4(1M)0.15ml0.40ml磷酸缓冲液(1M)Ph63.75ml10ml胆固醇（1.5g/ml）0.15ml0.40ml②LB液体培养基的配置按表2配置LB液体培养基表2LB液体培养基的配方LB液体培养基200mltyptone2gyeast1gNaCl1gdH2O200ml120℃灭菌15分钟③M9线虫生理溶液的配置按表3配M9线虫生理溶液表3M9线虫生理溶液的配方M9线虫生理溶液500mlKH2PO41.5gNa2HPO4,3gNaCl2.5gdH2O500ml120℃灭菌15分钟MgSO4(1M)0.5ml(3)仪器与溶液的灭菌①打开高压蒸汽灭菌锅，设置灭菌温度120℃和灭菌时间10分钟，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀，高压锅继续升温，自动灭菌。②在压力降到0.5MPa，可缓慢放出蒸气。当压力降到零后，才能开盖，取出灭菌物品。2.2.2倾倒NGM平板，摇菌与铺板（1）倾倒NGM平板①紫外灭菌无菌操作台5分钟。②双手用酒精消毒之后，点燃酒精灯。③待固体培养基冷却至60℃，在酒精灯附近逐一倾倒平板，保证每个平板有NGM固体培养基约10ml。④在培养皿皿盖上做好标记（包括组名，日期），待NGM固体培养基冷却后，如果不用菌液铺板，就用封口膜封口后倒置于4℃冰箱保存，如果菌液已经活化，则可直接铺板。（2）菌种的活化与铺板①紫外灭菌无菌操作台5分钟。②双手用酒精消毒之后，点燃酒精灯。③取出两管高压后的15ml离心管，用移液枪吸取液体配养基3ml,加入原始的OP50菌液300μl，过夜摇菌。④取200~300μl活化的菌液均匀地铺在NGM固体培养基里，用手摇动晃匀菌液，封口膜封口后，平置于操作台上待菌液被吸收。⑤等菌液被NGM固体培养基吸收后（一般20分钟），在37℃培养箱倒置培养，等细菌长出薄薄的一层（一般12-24hr）即可接线虫或倒置放在4℃冰箱保存。⑥摇菌剩余的菌种可以与甘油1比1混合，颠倒摇匀，至于-20℃保存。2.2.3.怀卵成虫的同步化（1）选择一个含有大量怀卵成虫的培养皿，用3mlM9洗下，放入5ml的塑料试管，加入0.8ml20%次氯酸钠，0.4ml0.5M的NaOH（事先配置次氯酸钠和NaOH各1ml）。10min后，虫体破裂，溶液变澄清。（2）3000转离心1min，弃上清。（3）4mlM9，混匀，3000rpm，离心1min，弃上清。（4）重复步骤（3）2~3次以去除残留的裂解液。（5）加入0.2mlM9，混匀。（6）将液体接种于NGM上，20℃培养，约56hr达到L4或20℃培养24hr,转至25℃培养大约21-22hr达到L4。2.2.4.EMS诱变和突变体筛选（1）无菌条件下，将培养皿中处于L4早期的雌雄同体线虫用5mlM9悬浮，用移液器转移至无菌离心管中。（2）1000rpm离心30s，去除上清，加入2mLM9。（3）另取一只离心管，加入M92ml以及20μlEMS，拧紧盖子，振荡混匀。（4）2mL含线虫M9倒入2mL含EMSM9中，混匀，用封口膜密封。（5）室温放置4~5h，混匀30min。（6）1000rpm离心30s，去除上清，加入3-4mLM9清洗。（7）重复（6）3~4次。（8）自然沉淀，去上清，留下1mL连同虫子转入NGM板上,每一个NGM板上加200ul，20℃培养2天后至产卵，移去成虫；（9）继续20℃培养若干天后连续观察，筛选能够稳定遗传的突变体及突变体的子代。3.结果在4×（或10×）显微镜下观察到的线虫突变体和对照组如图所示。3.1运动轨迹变化突变体图一运动轨迹变化突变体的筛选图一所示的是运动轨迹变化的突变体。图1是野生型线虫的运动轨迹，设为对照组，图2至图5是突变后线虫的运动轨迹，设为实验组。图2的运动轨迹较野生型相比更为平缓，图3的运动轨迹较野生型相比更为陡峭，而图4突变体的运动轨迹呈麻花状，图5突变体的运动轨迹极不规则并且十分纠结。这些都是可能是线虫的突变体，但我们发现运动轨迹奇怪的突变体的子代轨迹又往往正常化了，我们做了如下推测：①运动轨迹的突变体是不可遗传的，表现为运动轨迹突变体可能是由环境决定的，或者是线虫发生体细胞突变引起的；②运动轨迹的突变体发生的突变可能是隐形突变，因此在后代所占比例太少，而且运动轨迹在虫子太多的时候又难以观察，所以难以获得稳定的运动轨迹奇怪的稳定遗传的突变体；③运动轨迹奇怪的线虫本身并没有发生突变，可能是由于自身兴奋而产生了奇怪的运动轨迹。3.2形态特征变化突变体111211311411511123456图二形态特征变化突变体的筛选图二是形态特征变化的突变体。图1是野生型成体期线虫的形态特征，设为对照组，图2至图6是突变后线虫的形态特征，设为实验组。图2是严重卷曲，极少移动的成体期线虫突变体，图3是背部长小泡的成体期线虫突变体，图4是身体细长，并且头尾很尖的L4期线虫突变体，图5是短粗的成体期线虫突变体，图6是只能向左转弯的成体期运动障碍突变体。其中，在这几种突变体中，身体细长，并且头尾很尖的突变体和向左转弯的运动障碍突变体是可遗传的显性突变体，其他几种突变体的后代都是野生型形态的线虫，不是稳定的突变体。4.讨论（1）使用高压蒸汽灭菌锅时，一开始当压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后（也可以在5分钟之后），再关闭放气阀，以完全排除锅内空气，使灭菌才能彻底。（2）灭菌完后，如果时间紧急，可在压力降到0.5MPa，可缓慢放出蒸气。当压力降到零后，才能开盖，取出灭菌物品。（3）所配置的液体培养基高压后要分装在几个小量程的锥形瓶中，这样如果操作过程中液体培养基被污染，可防止配置的液体培养基全被污染。（4）摇菌的时候一种菌摇两管，这样可以保证如果一管菌的菌种引入了杂菌，另一管菌液如果没被污染就还能用。（5）无菌操作台在使用前应该先紫外灭菌5分钟，操作之前双手也应该用酒精消毒，以防止操作过程中造成实验污染。（6）细菌要倒置培养，防止水蒸气滴到固体培养基上，影响微生物的生长、线虫的运动和杂菌污染。（7）在用菌液铺板时，如果培养的是野生型线虫，为了让线虫均匀地在培养基上大量生长，需要均匀地铺板，如果是观察诱变体，则将菌液集中滴在中间，使线虫集中生长，利于观察突变体。（8）在做同步化的时候，一定要观察到培养皿上有大量化卵成虫再做同步化，不然得到的同步化的虫子会特别少。（9）如果同步化得到的虫子很少，有两种方法补救：①找一个含有大量化卵成虫的皿再做同步化；②在野生型线虫培养基上选取一块线虫生长时期相同的区域，挖下来，接到新的培养基上，多挖几块继续培养，这样数小时后得到的虫子基本还应该是同一时期的。在做同步化的时候可以多同步化几个板，这样如果一个板同步化失败了，还会有一个板可以补救。（10）诱变过程中一定要将EMS洗干净，否则