草鱼烂尾病病原细菌Y2的分离鉴定与中西药物敏感性分析

武汉轻工大学毕业论文2013届毕业论文题目：草鱼烂尾病病原细菌Y2的分离鉴定与中西药物敏感性分析姓名蔡庐山学号090702228院（系）动物科学与营养工程学院专业水产养殖学年级2009级指导教师刘洪明武汉轻工大学制2013年05月目录摘要··················································································11、前言·················································································22、材料与方法········································································92.1细菌分离··································································92.2病原菌的生理生化鉴定················································92.3待测细菌WH125的分子生物学鉴定······························112.4细菌的药物敏感性测定··············································123、结果················································································133.1病鱼症状·································································133.2病原菌的生理生化鉴定···············································133.3分子生物学鉴定结果··················································163.4菌种判定·································································183.5药敏试验结果···························································184、讨论················································································19参考文献··············································································221草鱼烂尾病病原细菌Y2的分离鉴定摘要本文从实验室患病草鱼身上分离得到一株致病菌，通过对细菌分离培养与纯培养、形态与菌落特征、理化特性等表观分类学指征鉴定的测定；同时择代表菌株进行了16SrRNA基因的分子鉴定，测定了16SrRNA基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性、构建了系统发生树；以表型性状鉴定结果，及细菌发育学分析的结果，进行分离菌的种属判定。结果表明所检鱼病的致病菌为草鱼烂尾病病原细菌Y2。同时还对该病菌进行了药物敏感性测定，明确了该菌对各种中西药的敏感性，为治疗由草鱼烂尾病病原细菌Y2所引起的水产动物疾病提供了理论基础。关键词：草鱼烂尾病病原细菌Y216SrRNA药物敏感性IsolationandidentificationofpathogenicbacteriaY2ofGrasscarptailrotAbstractInthispaper,apathogenicbacteriastrainswereisolatedfromlaboratorysickgrasscarp.Cultivationofbacteriaandpureculture,morphologyandcolonycharacteristics,physicalandchemicalpropertiessuchasapparenttaxonomicalindicationsidentifiedmeasurement.Inaddition,molecularidentificationofanalysisofthenucleotidesequenceofthe16SrRNAgenewereapplied,the16SrRNAgeneweresequencedandthephylogenetictreerepresentinggeneticrelatednessamongtheisolatesandpubliclyavailable16SrRNAgenesequencefromGenBankdatabasewasconstructed;theresultsshowedthattheisolateswereAeromonasveronii.TheAntimicrobialsusceptibilitiesofselectedstrainstoantimicrobialagentsweredetermined,ResultsshowthatthepathogenicbacteriaforgrasscarpfishdiseasearelousytaildiseasepathogenbacteriaY2,andthesensitiveagentswereselectedinthisstudy,FortreatmentofgrasscarplousytaildiseasecausedbypathogenicbacteriaY22aquaticanimaldiseasesprovidesatheoreticalbasisKeywords:GrasscarplousytaildiseasepathogenbacteriaY216SrRNAAntimicrobialsusceptibilitytest(AST)31前言烂尾病是一种常见病，无论是在养鱼池、水族箱、网箱、网围、网栏、水库中养殖的草鱼、斑点叉尾鮰、罗非鱼、鳗鲡、暗纹东方鲀、鲤、鲫等多种淡水鱼都经常可以发生。只要鱼尾部被擦伤，或被寄生虫等损伤后，鱼体抵抗力下降，水质又较污浊，养殖密度高，水中病原菌又较多时，就容易暴发流行，引起鱼种大批死亡。随着鱼类的养殖面积不断扩大，养殖生产中的病害时有发生，根据“2009年中国水产养殖动植物病情监测报告”初步统计，全国鱼类因病害造成的直接经济损失达到52.42亿元，因此加强对鱼类病害的研究十分必要[1]。近十多年来，随着研究技术的发展，该领域的研究工作日益活跃，细菌性疾病常导致养殖和野生鱼类的大量死亡，因此对鱼类细菌性疾病的研究一直是鱼病学主要的研究领域之一[2]。徐伯亥等(1986)报道，草鱼尾柄病(又称烂尾病)的病原菌为温和气单胞菌。将赤皮病的病原菌荧光假单胞菌、打印病的病原菌嗜水气单胞菌、细菌性烂鳃病的病原菌柱状屈桡杆菌分别人工涂抹、浸泡、注射尾部受伤的草鱼，均可使草鱼患烂尾病。反之，将温和气单胞菌人工感染体侧受伤的鲢、鳙，则患打印病；人工感染体侧受伤的草鱼，则患赤皮病。因此，草鱼烂尾病的病原菌可能不仅一种，而是有多种。只要尾部受伤后，上述几种菌都可感染引起患烂尾病；对鱼类细菌病一些快速鉴定方法已问世，具体手段如下：1.1常用的细菌鉴定法1.1.1选择培养基法能抑制多数细菌，仅利于某一种或者某一类细菌生长的培养基称为选择培养基。选择培养基制作简单，使用方便，已被不少鱼病实验室采用。例如：Rimler-shotts培养基[4]（R.S琼脂培养基）用于识别腐皮病的病原嗜水气单胞菌，伊红美蓝培养基[5]既是对大肠埃希氏菌的鉴别培养基，同时也可以根据需要作为其生长的选择培养基。1.1.2经典分类法这是近100年来进行微生物分类的传统方法，其特点是利用细胞体上随机和非系统观察的试验结果，根据某些主要或显著的特征性状进行分类。其常用的特征主要是形态和生理生化特点，并在分类时将特征分为主要和次要特征，一般将结构和形态特点作为初步分类特征，在许多情况下，把它们看成比生理、生化特征更重要的特征。最后应用双岐法整理实验结果，排列出分类类群，亦即通常把上述主次相关特征性状依《伯杰氏细菌鉴定手册》[6]检索表，便可查出待检菌株的学名与分类归属（中科院微生物研究所细菌分类组，1978）。41.1.3荧光抗体技术荧光抗体技术根据抗原抗体反应具有高特异性的特点，以荧光素作为标记物、与已知的抗体结合作为标准试剂，用于鉴定未知抗原(在荧光显微镜下检查呈现荧光的特异抗原抗体复合物及存在部位)。吴淑勤等应用间接荧光抗体技术(IFAT)对鳗鲡混合感染迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌进行了检测。用这种方法测定混合感染的准确率较高，达到或超过细菌培养法的水平(尤其是对早期无症状的感染)。该技术快速简便，一组平行集合的组织涂片，分别滴加爱德华氏菌抗血清和几种嗜水气单胞菌地区优势血清型抗血清，按常规步骤操作，2h内可完成取样至镜下观察全过程,确定是混合感染还是单纯感染。1.1.4免疫酶技术该技术把抗原抗体的免疫反应与酶的高效催化作用有机结合起来，通过酶的活性降解底物呈现颜色反应，以示抗原抗体特异性反应的存在，免疫酶技术种类较多，目前常用的有ELISA、Dot-ELISA等。钱冬等用酶联免疫吸附法检测细菌性败血症病原嗜水气单胞菌，其方法是先制备兔抗AhTPS-30的抗血清，再用抗血清包被，兔抗体特异性地结合待测病原菌，建立了双夹心ELISA法。该法可检测出9.77×10个/ml菌，相当于10ng抗原，与点状气单胞菌、温和气单胞菌等菌株不发生交叉反应，对白鲫人工感染的病原菌，检出率达85％以上。整个过程仅需1.5h。沈素芳等应用点酶法(Dot-ELISA)检测鱼类致病性嗜水气单胞菌重要致病因子ECPase并研制出检测试剂盒。这种方法敏感性高、重复性好，具有较强的特异性，且可同时检测大量样本，并能区分致病性与非致病性。1.1.5单克隆抗体技术单克隆抗体是一个抗体产生细菌与一个骨髓瘤细胞融合而产生得到杂交瘤细胞经无性繁殖的细胞群所产生的，用其检测病原的优点在于它对抗原位点的特异性及保持细胞系重复获得相同抗体的能力。1.1.6PCR(聚合酶链反应)技术PCR(Polymerasechainreaction)技术已应用于诊断隐性疾病，检测临床标本病原体及法医遗传鉴定，最近也被用于水生动物疾病病原的诊断。陆承平等选用气单胞菌毒素基因中保守区的同源寡核苷酸序列为引物，用PCR技术检测临床分离的嗜水气单胞菌的毒素基因，获得较为满意的结果。1.17快速细菌鉴定的方法根据细菌的生化特性，研究生产了多种多样的细菌鉴定系统，它们使用简单，5能在较短时间内鉴别出病原菌。1.1.8API-20E系统API20E是目前世界上应用最为广泛的细菌鉴定系统，主要由含20种脱水基质的微型管组成的API试验条、试验结果读数表和检测试剂等组成。美国试验条可对1株细菌进行23个生化实验。API20E主要用于检测发酵型革兰氏阴性杆菌，可对98种肠道革兰氏阴性杆菌进行准确鉴定。1.1.9FAME(FattyAcidMethylEster)系统在标准培养条件下培养细菌，然后抽提其脂肪酸，再进行气相色谱，分析所得数据进行细菌鉴定。FAME分析仪（MIDI，Newark,USA）能将细菌的细胞膜上磷脂转化为甲酯，然后通过对基本组成分析和图谱识别软件将所检测的细菌鉴定到种或亚种。目前用气相色谱的脂肪酸分析仪已广泛应用于鉴定临床和环境来源的细菌。多年来，短链脂肪酸（挥发掾酸，VFAs）分析仪已被用于常规鉴定厌氧细菌。在细菌中已发现越过300种脂肪酸和相关组分。通过检测细菌有或没有每种脂肪酸及其脂肪酸含量来确定细菌种类。理论上可以区别2300种不同的组成，但实际是达不到的，因