荧光光谱分析

-1-第十七章荧光光谱分析当紫外线照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外线停止照射时，所发射的光线也随之很快地消失，这种光线被称为荧光。西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes于1575年第一次记录了荧光现象。17世纪，Boyle和Newton等著名科学家再次观察到荧光现象。17世纪和18世纪，又陆续发现了其它一些发荧光的材料和溶液，但是在荧光现象的解释方面却没有什么进展。1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍长，才判明这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念。同时，他由发荧光的矿物“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。1867年，Coppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝-桑色素配合物的荧光进行铝的测定。1880年，Liebeman提出了最早的关于荧光与化学结构关系的经验法则。到19世纪末，人们已经知道了600种以上的荧光化合物。20世纪以来，荧光现象被研究得更多了。例如，1905年Wood发现了共振荧光；1914年Frank和Hertz利用电子冲击发光进行定量研究；1922年Frank和Cario发现了增感应光；1924年Wawillow进行了荧光产率的绝对测定；1926年Gaviola进行了荧光寿命的直接测定等。荧光分析方法的发展离不开仪器应用的发展。19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West研制出第一台光电荧光计。早期的光电荧光计的灵敏度是有限的，1939年Zworykin和Rajchman发明光电倍增管以后，在增加灵敏度和容许使用分辨率更高的单色器等方面，是一个非常重要的阶段。1943年Dutton和Bailey提出了一种荧光光谱的手工校正步骤，1948年由Studer推出了第一台自动光谱校正装置，到1952年才出现商品化的校正光谱仪器。荧光光谱分析法除了可以用作组分的定性检测和定量测定的手段之外，还被广泛地作为一种表征技术应用于表征所研究体系的物理、化学性质及其变化情况。例如，在生命科学领域的研究中，人们经常可以利用荧光检测的手段，通过检测某种荧光特定参数（如荧光的波长、强度、偏振和寿命）的变化情况来表征生物大分子在性质和构象上的变化。很多化合物由于本身具有大的共轭体系和刚性的平面结构，因而具有能发射荧光的内在本质，我们称这些化合物为荧光化合物。在某些所要研究的体系中，由于体系自身含有这种荧光团而具有内源荧光，人们就可以利用其内源荧光，通过检测某种荧光特性参数的变化，对该体系的某些性质加以研究。但是，如果所要研究的体系本身不含有荧光团而不具有内源荧光，或者其内源性质很弱，这时候就必须在体系中外加一种荧光化合物即所谓荧光探针，再通过测量荧光探针的荧光特性的变化来对该体系加以研究。例如，如果我们要检测体系的极性，便可以将对极性敏感的荧光探针加入到体系中，然后通过对荧光探针的荧光特性的检测，求得体系的极性，或通过探针的荧光特性的变化来表征体系的极性的变化情况。荧光分析法之所以发展如此迅速，应用日益广泛，其原因之一是荧光分析法具-2-有很高的灵敏度。在微量分析的各种方法中，应用较为广泛的有比色法和分光光度法。但在方法的灵敏度方面，荧光分析法的灵敏度一般要比这两种方法高2～3各数量级。随着现代电子技术的迅速发展，对于微弱光信号检测的灵敏度已大大提高，荧光分析的灵敏度常可达亿分之几，在与毛细管电泳分离技术结合、采用激光诱导荧光检测法时，已能接近或达到单分子检测的水平[1]荧光分析法的另一个优点是选择性高。这主要是对有机化合物的分析而言。吸光物质由于内在本质的差别，不一定都会发荧光，况且，发荧光的物质彼此之间在激发波长和发射波长方面可能有所差异，因而通过选择适当的激发波长和荧光测定波长，便可能达到选择性测定的目的。另外，由于荧光的特性参数较多，除量子产率、激发与发射波长之外，还有荧光寿命、荧光偏振等。因此，还可以通过采用同步扫描、导数光谱、三维光谱、时间分辨和相分辨等一些荧光测定新技术进一步提高测定的选择性。除灵敏度高和选择性好之外，动态线性范围宽，方法简便，重现性好，取样量少，仪器设备不复杂等等，也是荧光分析法的优点。近年来，在其他学科迅速发展的影响下，激光、微处理机、电子学、光导纤维和纳米材料等方面的一些新技术的引入，很大程度上推动了荧光分析法在理论和应用方面的进展，促进了诸如同步荧光测定、倒数荧光测定、时间分辨荧光测定、相分辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温荧光测定、固体表面荧光测定、近红外荧光分析法、荧光反应速率法、三维荧光光谱技术、荧光显微与成像技术、空间分辨荧光技术、荧光探针技术、单分子荧光检测技术和荧光光纤化学传感器等荧光分析方面的某些新方法、新技术的发展，并且相应地加速了各式各样新型的荧光分析仪器的问世，使荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观、实时、原位和自动化的方向发展，方法的灵敏度、准确度和选择性日益提高，方法的应用范围大大扩展，遍及工业、农业、生命科学、环境科学、材料科学、食品科学和公安情报等诸多领域。如今，荧光分析法已经发展成为一种十分重要且有效地光谱化学分析手段。17.1基本原理荧光是一种光致发光现象，那么，由于分子对光的选择性吸收，不同波长的入射光便具有不同的激发频率。如果固定荧光的发射波长（即测定波长）而不断改变激发光（即入射光）的波长，并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对激发波长的谱图称为荧光的激发光谱（简称激发光谱）。如果使激发光的波长和强度保持不变，而不断改变荧光的测定波长（即发射波长）并记录相应的荧光强度，所得到的荧光强度对发射波长的谱图则称为荧光的发射光谱（简称发射光谱）。激发光谱反映了在某一固定的发射波长下所测量的荧光强度对激发波长的依赖关系；发射光谱反映了在某一固定的激发波长下所测量的荧光的波长分布。激发光谱和发射光谱可用以鉴别荧光物质，并可作为进行荧光测定时选择合适的激发波长和测定波长的依据。荧光测量仪器有各自的特性，如光源的能量分布、单色器的透射率和检测器的敏感度都随波长而改变，因而一般情况下测得的激发光谱和发射光谱，皆为表观的光谱。同一份荧光化合物的溶液在不同的荧光测量仪上所测得的表观光谱彼此间往往有所差异。只有对上述仪器特性的波长因素加以校正之后，所获得的校正光谱（或称真是光谱）才可能是彼此一致的。某种化合物的荧光激发光谱的形状，-3-理论上应与其吸收光谱的形状相同，但是由于上述仪器特性的波长因素，表光激发光谱的形状与吸收光谱的形状大都有所差异，只有校正的激发光谱才与吸收光谱非常接近。在化合物的浓度足够小，对不同波长激发光的吸收正比于其吸光系数，且荧光的量子产率与激发波长无关的条件下，校正的激发光谱在形状上与吸收光谱相同。分子的吸收光谱可能含有几个吸收带，但其发射光谱却通常只含有一个发射带。绝大多数情况下即使分子被激发到S2电子态以上的不用振动能级，但是由于内转化和振动松弛的速率是那样的快，以致很快地丧失多余的能量而衰变到S1态的最低振动能级，然后发射荧光，因而其发射光谱通常只含一个发射带，且发射光谱的形状与激发波长无关，只与基态中振动能级的分布情况以及各振动带的跃迁概率有关。但是也有例外，例如有些荧光体具有两个电离态，而每个电离态显示不同的吸收和发射光谱，等等。物质在吸收入射光的过程中，光子的能量传递给了物质分子。分子被激发后，发生了电子从较低的能级到较高能级的跃迁。该跃迁过程经历的时间约10-15s。跃迁所涉及的两个能级间的能量差，等于所吸收光子的能量。紫外、可见光区的光子能量较高，足以引起分子中的电子发生电子能级间的跃迁。处于该激发态的分子称为电子激发态分子。电子激发态的多重态用2S+1表示，S是电子自旋角动量量子数的代数和，其数值为0或1。分子中同一轨道里同一轨道里所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自选配对。如果分子中的全部电子都是自旋配对的，即S=0，该分子便处于单重态（或称单线态），用符号S表示。大多数有机物分子的基态是处于单重态的。如果分子吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，这时分子处于激发的单重态；倘若电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，这时分子便具有两个自旋不配对的电子，即S=1，分子处于激发的三重态（或称三线态），用符号T表示。符号S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发单重态，T1和T2则分别表示第一和第二电子激发三重态。处于激发态的分子不稳定，它可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁的衰变过程而返回基态。另外，激发态分子也可能由于分子间的作用过程而失活。辐射跃迁的衰变过程伴随着光子的发射，即产生荧光活磷光；非辐射跃迁的衰变过程，包括振动松弛（VR）、内转化（ic）、和系间窜越（isc），这些衰变过程导致激发能转化为热能传递给介质。振动松弛是指分子将多余的振动能量传递给介质而衰变到同一电子态的最低振动能级的过程。内转化指相同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁过程（例如S1～S0，T2～T1）；系间窜越则指不同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁过程（例如S1～T1，T1～S0）。图5.6.1为分子内所发生的激发过程以及辐射跃迁和非辐射跃迁过程的示意图。-4-图5.6.1分子内的激发和衰变过程A1.A2.吸收；F.荧光；P.磷光；ic.内转化；isc.系间窜越；VR.振动松弛.如果分子被激发到S2以上的某个电子激发单重态的不同振动能级上，处于这种激发态的分子很快（约10-12～10-14s）发生振动松弛而衰变到该电子态的最低振动能级，然后又经由内转化及振动松弛而衰变到S1态的最低振动能级。接着，有如下几种衰变到基态的途径：①S1→S0的辐射跃迁而发射荧光；②S1～S0内转化；③S1～T1系间窜越。而处于T1态的最低振动能级的分子，则可能发生T1～S0的辐射跃迁而发射磷光，也可能同时发生T1～S0系间窜越。从比较荧光与激发光的波长这一角度出发，荧光又可分为斯托克斯（Stokes）荧光、反斯托克斯荧光以及共振荧光。斯托克斯荧光的波长比激发光源的长，反斯托克斯荧光的波长则比激发光源的短，而共振荧光具有与激发光相同的波长。在溶液中观察到的通常是斯托克斯荧光。由荧光在电磁辐射中所处的波段范围，又有X射线荧光、紫外荧光、可见荧光和红外荧光之分。17.2基本构成及其工作原理荧光光谱仪由光源、单色器（滤光片或光栅）、狭缝、样品室、信号检测放大系统和信号读出、记录系统组成。光源用来激发样品，单色器用来分离出所需要的单色光，信号检测放大系统用来把荧光信号转化为电信号，联结于放大装置上的读出装置用来显示或记录荧光信号。下面介绍现用仪器（即法国HoribaJobinYvon生产的FluorLog-3荧光光谱仪）的各组件。1、激发光源理想化的激发光源：由于荧光体的荧光强度与激发光的强度成正比，因此，作-5-为一种理想的激发光源应具备：①足够的强度；②在所需光谱范围内有连续的光谱；③其强度与波长无关，即光源的输出应是连续平滑等强度的辐射；④光强要稳定。符合这些要求的光源实际上并不存在。可作为激发光源的主要有氙灯、汞灯、氙-汞弧灯、激光器以及闪光灯。高压氙弧灯是荧光光谱仪中应用最广泛的一种光源。本仪器所用的激发光源即为450W氙灯。这种光源是一种短弧气体放电灯，外套为石英，内充氙气，室温时其压力为5atm，工作时压力约为20atm。250～800nm光谱区呈连续光谱，450nm附近有几条锐线。其工作时，在相距约8mm的钨电极间形成一强的电子流（电弧），氙原子与电子流相撞而离解为氙正离子，氙正离子与电子复合而发光。氙原子的离解发射连续光谱，而激发态的氙则发射分布于450nm附近的线状光谱。氙弧灯的光谱输出，短于280nm区的强度迅速下降。有的氙弧灯为无臭氧灯，即工作时氙灯周围不产生臭氧，这种灯所用的石英外套不投射波长短于250nm的光，但这种灯的输出信号强度随波长缩短而迅速下降。工作时，氙灯灯光很强，其射线会损伤肉眼视网膜