荧光分析法ppt2

第十一章荧光分析法荧光荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。在日常生活中，人们通常广义地把各种微弱的光亮都称为荧光，荧光器具荧光粉荧光棒荧光增白剂荧光笔荧光粉荧光粉(俗称夜光粉)，通常分为光致储能夜光粉和带有放射性的夜光粉两类。光致储能夜光粉是荧光粉在受到自然光、日光灯光、紫外光等照射后，把光能储存起来，在停止光照射后，在缓慢地以荧光的方式释放出来，所以在夜间或者黑暗处，仍能看到发光，持续时间长达几小时至十几小时。带有放射性的夜光粉，是在荧光粉中掺入放射性物质，利用放射性物质不断发出的射线激发荧光粉发光，这类夜光粉发光时间很长，但因为有毒有害和环境污染等，所以应用范围小。荧光棒荧光棒中的化学物质主要由三种物质组成：过氧化物、酯类化合物和荧光染料。简单地说，荧光棒发光的原理就是过氧化物和酯类化合物发生反应，将反应后的能量传递给荧光染料，再由染料发出荧光。目前市场上常见的荧光棒中通常放置了一个玻璃管夹层，夹层内外隔离了过氧化物和酯类化合物，经过揉搓，两种化合物反应使得荧光染料发光。五颜六色的荧光棒荧光增白剂荧光增白剂是一种荧光染料，或称为白色染料，也是一种复杂的有机化合物。它的特性是能激发入射光线产生荧光，使所染物质获得类似荧石的闪闪发光的效应，使肉眼看到的物质很白，达到增白的效果。荧光笔荧光笔有荧光剂，它遇到紫外线（太阳光、日光灯、水银灯比较多）时会产生荧光效应，发出白光，从而使颜色看起来有刺眼的荧光感觉。如今也有可以隐藏的无色荧光笔，书写后没有颜色，用笔后面的紫光灯照射后即可显示书写的内容。荧光材料有机染料无机硫化物稀土材料本章基本要求：⒈理解分子荧光的基本原理；⒉理解分子荧光激发光谱、发射光谱的含义；⒊掌握分子荧光发射光谱的特征；⒋了解荧光光谱仪的组成及部分作用；⒌掌握荧光分析法的主要应用范围。第一节荧光分析法的基本原理一、分子荧光㈠分子荧光的产生分子吸收电磁辐射后处于激发态，激发态分子经历碰撞及发射的去激发过程。一般用Jablonski能级图来定性描述分子吸收和发射过程。⒈分子的电子能级与激发过程物质的分子体系中存在着电子能级、振动能级和转动能级。由于一般的光谱仪器分辨不出转动能量，因而Jablonski能级图中未画出转动能级。分子吸收和发射过程的Jablonski能级能级图S032103210T2S1321021043210S2T1λ1λ2λ3λ4吸收吸收荧光磷光(2)荧光发射当分子处于第一激发单重态S1的最低振动能级时，分子可能通过发射光子跃迁回到基态S0的各振动能级上，这个过程称为荧光发射。荧光发射过程约为10-8s.(3)外部能量转换激发态分子与溶剂和其它溶质分子间的相互作用及能量转换等过程称为外部能量转换。外转换过程是荧光或磷光的竞争过程，因该过程发光强度减弱或消失，该现象称为“猝灭”或“熄灭”。(4)磷光发射激发态分子经过系间跨越到达激发三重态后，并迅速的以振动弛豫到达第一激发三重态(T1)的最低振动能级上，第一激发三重态分子经发射光子返回基态。此过程称为磷光。磷光发射是不同多重态之间的跃迁(T1→S0)属于“禁阻”跃迁，因此磷光的寿命比荧光要长的多，约为10-3s～10s。所以，将激发光从磷光样品移走后，还常可观察到发光现象，而荧光发射却观察不到该现象。二、荧光寿命和荧光效率荧光寿命和荧光效率是荧光物质的重要发光参数㈠荧光寿命荧光寿命是当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间，常用τf表示。当荧光物质受到一个极其短暂的光脉冲激发后，荧光强度的变化可用下列公式表示：0KttFFe㈡荧光效率荧光效率也称荧光量子效率，是发射荧光的分子数与总的激发态分子数之比。也可定义为物质吸光后发射的荧光的光子数与吸收的激发光的光子数之比。荧光的去激发过程：①发射荧光返回基态(强的荧光物）②无辐射跃迁回到基态(低荧光物质)f发射荧光的光子数吸收激发光的光子数三、荧光的激发光谱和发射光谱任何荧光分子都具有两种特征的光谱，即激发光谱和荧光光谱。⒈荧光激发光谱激发光谱是通过固定发射波长，扫描激发波长而获得的荧光强度(F)—激发波长(λex)的关系曲线。激发光谱反映了在某一固定的发射波长下，不同激发波长激发的荧光的相对效率。激发光谱可以用于荧光物质的鉴别，并作为进行荧光测定时供选择恰当的激发波长。⒉荧光发射光谱通过固定激发波长，扫描发射(即荧光测定)波长所获得的荧光强度(F)—发射波长(λem)的关系的曲线为荧光发射曲线。荧光光谱反映了在相同的激发条件下，不同波长处分子的相对发射强度。荧光光谱可用于荧光物质的鉴别，并作为荧光测定时选择恰当的测定波长或滤光片。⒊同步荧光光谱1971年Lloyd提出用同步扫描技术来绘制光谱图。该技术是在同时扫描激发和发射单色器波长的条件下，测绘光谱图，所得到的荧光强度—激发波长(或发射波长)曲线为同步荧光光谱。荧光信号同步信号测定同步荧光光谱的三种方法：⑴固定波长同步扫描法：在扫描过程中，激发波长和发射波长有一个固定的波长差，即Δλ=λem－λex=常数⑵固定能量同步扫描法：使发射单色器与激发单色器之间保持一个恒定的波数差，即（1/λex－1/λem）×107=常数。⑶可变波长同步扫描法：使两单色器在扫描过程中以不同的速率同时进行扫描，即波长可变。同步荧光光谱的特点：⑴使光谱简化；⑵使谱带窄化；⑶减小光谱的重叠现象；⑷减小散色光的影响。这种光谱提高了分析测定的选择性，避免了其它谱带所引起的干扰。但对光谱学的研究不利，因为它损失了其它光谱所含的信息。四、荧光光谱的特征⒈斯托克斯(Stokes)位移在溶液中，分子的荧光发射波长总是比其相应的吸收(或激发)光谱的波长长。荧光发射这种波长位移的现象称为Stokes位移。原因：处于激发态的分子一方面由于振动弛豫等损失了部分能量，另一方面溶剂分子的弛豫作用使其能量进一步损失，因而产生了发射光谱波长的位移。Stokes位移表明在荧光激发和发射之间所产生的能量损失。（见P220图11-3）⒉镜像对称规则一般而言，分子的荧光发射光谱与其吸收光谱之间存在着镜像关系。（见P220图)镜像对称规则的产生是由于大多吸收光谱的形状表明了分子的第一激发态的振动能级结构，而荧光发射光谱则表明了分子基态的振动能级结构。一般情况下，分子的基态和第一激发单重态的振动能级结构类似，因此吸收光谱的形状与荧光发射光谱的形状呈镜像对称关系。⒊荧光光谱的形状与激发波长无关用不同波长的激发光激发荧光分子，可以观察到形状相同的荧光发射光谱。这是由于荧光分子无论被激发到哪一个激发态，处于激发态的分子经振动弛豫及内转换等过程后最终回到第一激发态的最低振动能级。而分子的荧光发射总是从第一激发态的最低振动能级跃迁到基态的各振动能级上。五、影响荧光强度的因素荧光是由具有荧光结构的物质吸收光后产生的，其发光强度与该物质分子的吸光作用及荧光效率有关，影响物质荧光强度的因素主要有两个：㈠分子结构一般具有强荧光的分子都具有大的共轭π键结构、供电子取代基、刚性的平面结构等。分子中至少具有一个芳环或具有多个共轭双键的有机化合物才容易发射荧光，而饱和的或只有孤立双键的化合物，不呈现显著的荧光。㈡发光分子所处的环境荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的影响。因此适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的灵敏度和选择性。㈠分子结构⑴跃迁类型：大多数荧光化合物多是由π→π＊或n→π＊跃迁所致的激发态去活后，发生π＊→π或π＊→n跃迁产生的。π＊→π跃迁的量子效率高，是由于π→π＊跃迁的摩尔吸光系数比n→π＊跃迁大100～1000倍,跃迁的寿命(10-7～10-9s)又比n→π＊(10-5～10-7）跃迁寿命短，因此Kf较大；其次，系间跨越的速率常数小，有利于发射荧光。⑵共轭效应①含有π→π＊跃迁能级的芳香族化合物的荧光最强，最有用。②含脂肪族和脂环族羰基结构的化合物也会发射荧光，但这类化合物的数量比芳香族少。③稠环化合物一般会产生荧光。④最简单的杂环化合物（吡啶、呋喃、噻吩、吡咯）等不产生荧光。⑤当苯环被稠化至杂环核上时，吸收峰的摩尔吸光系数增加，因此喹啉、吲哚等会产生荧光。⑶取代基效应苯环上的取代基会引起最大吸收波长的位移及相应荧光峰的改变。①给电子基团，使荧光增强。如:－NH2,－OH,－OCH3,－NHCH3和－N(CH3)2等，②吸电子基团，使荧光减弱如:－Cl,－Br,－I,－NHCOCH3,－NO2和－COOH等，。⑷分子的刚性效应①在同样长共轭分子中，分子的刚性越强，荧光效率越大。②本来不发生荧光或荧光较弱的物质与金属离子形成配位化合物后，如果刚性共平面性增加，则可以产生荧光或增强荧光。如：8-羟基喹啉本身是弱荧光物质，与Mg2+、Al3+形成配位化合物后，荧光增强。③顺反异构体的荧光性ff联苯芴=0.2=1.0㈡环境因素荧光分子所处的溶液环境对其荧光发射有直接的影响。适当的选取实验条件有利于提高荧光分析的灵敏度和选择性。⑴溶剂效应①溶剂的极性：溶剂的极性增大，π→π＊跃迁的能量减小，红移。②溶剂的粘度溶剂的粘度降低，分子间碰撞机会增加，无辐射跃迁几率增加，荧光减弱。⑵温度的影响由于当温度降低时，溶剂的粘度增大，溶剂的弛豫作用大大减小，荧光发射几率增加；当温度升高时，碰撞频率增加，外转换的去激发几率增加，荧光发射几率变小。一般地，随温度降低，溶液中荧光效率和荧光强度将增大，并伴随光谱的蓝移。因此，选择低温条件进行荧光检测将有利于提高分析的灵敏度。⑶pH的影响①对于含有酸性或碱性基团的荧光物质而言，溶液的pH将对这类物质的荧光强度产生较大的影响。如：在pH7～12的溶液中，苯胺以分子形式存在，产生蓝色荧光；当pH＜3、pH＞13时，苯胺以阳离子、阴离子形式存在，均无荧光。②溶液的pH也影响金属配合物的荧光性质。⑷荧光猝灭荧光猝灭：荧光分子与溶剂或其它溶质分子之间相互作用，使荧光强度减弱的作用。荧光猝灭剂：能引起荧光强度降低的物质。①动态猝灭：被激发的荧光分子与猝灭剂发生碰撞，使荧光分子以无辐射形式跃迁回到基态而使荧光猝灭。②静态猝灭：荧光分子与猝灭剂形成不发光的基态配合物从而使荧光猝灭。氧是最常见的碰撞猝灭剂，因此在较严格的荧光实验室中，需要除氧。利用荧光的这两种猝灭作用可以检测猝灭剂的浓度。③自猝灭：当荧光物质的浓度较大时，会产生激发态的荧光分子与基态的荧光分子碰撞从而使荧光猝灭。因此在荧光测量中，荧光物质的浓度不应太大。④当物质中存在能与荧光分子发生能量转移的物质时，有时也使体系的荧光强度下降。⑸内滤作用内滤作用：当溶液中存在能吸收荧光物质的激发光或发射光的物质时，会使体系荧光减弱的现象。⑹散射光散射光对荧光测定有干扰，尤其是波长比入射光波长更长的拉曼光。选择适当的激发波长可消除此干扰。例：见书224～225页第二节荧光定量分析方法一、荧光强度与物质浓度的关系I0IF①在ECl≤0.05时，F=KC,溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系；②在ECl＞0.05，溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度不呈线性关系；③荧光分析法的测定灵敏度高。二、定量分析法⒈校正曲线法⒉比例法⒊联立方程式法0SSXOXFFCFFC00XXSSFFCCFF第三节荧光分光光度计第四节荧光分析新技术简介掌握内容：⒈分子荧光的发生过程；⒉激发光谱和发射光谱；⒊激发光谱的特征；⒋影响荧光强度的内、外部因素。熟悉内容：⒈分子从激发态返回基态的各种途径；⒉荧光寿命与荧光效率；⒊荧光定量分析法。了解内容：⒈荧光分光光度计与荧光分析新技术。