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生物仪器分析综述——荧光显微镜分析技术荧光显微镜分析技术摘要：荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一，已有100多年历史。近年来,由于免疫荧光在医学研究、诊断领域里的广泛应用,FISH、绿色荧光蛋白(GFP)技术分别在基因组学、蛋白质组学研究方面的推广,显微照相、数字CCD成像技术的辅助驱动,赋予这一传统技术更新的应用价值和生命力。本文主要介绍荧光显微镜的结构、原理、操作及应用、特点。关键词：荧光显微镜、原理、操作方法、应用、特点1.鉴别荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：1）照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上；2）光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；3）有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人眼。荧光显微镜也是光学显微镜的一种，主要的区别是二者的激发波长不同。由此决定了荧光显微镜与普通光学显微镜结构和使用方法上的不同。2.荧光显微镜原理及结构特点荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高，主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。荧光光源——般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断(或压制)滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免于扰荧光和损伤眼睛，二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。要根据对显微荧光观测技术的实际需求,考虑以下因素,配置相应的功能附件：1)荧光照明器个别厂家的荧光光源收光镜在质量上有消色差和复消色差两种,前者可满足常规工作,特殊研究可选后者。如果观测样品荧光亮度强,可选配适当透过率的ND滤光片。2)激发/发射滤光片组件理论上应当针对拟使用的荧光色素或样品的荧光特性选择对应波谱的激发/发射荧光组件,做到合理搭配,但由于组件的种类繁多且价格较贵,一般常配宽带/长通滤光片组件。如果实验条件明确,则可以选择窄带/短通组件,如GFP、FISH观察。当然还有多波长组合,同时观测多个荧光光谱。除荧光显微镜生产厂家外,还可以向专门生产激发/发射滤光片的厂家(如,Chroma,Omega等)订购。3）反光镜反光镜的反光层一般是镀铝的，因为铝对紫外光和可见光的蓝紫区吸收少，反射达90%以上，而银的反射只有70%；一般使用平面反光镜。4）聚光镜专为荧光显微镜设计制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明视野聚光器的暗视野聚光器两种。还有相差荧光聚光器。（1）明视野聚光器在一般荧光显微镜上多用明视野聚光器，它具有聚光力强，使用方便，特别适于低、中倍放大的标本观察。（2）暗视野聚光器暗视野聚光器在荧光显微镜中的应用日益广泛。因为激发光不直接进入物镜，因而除散射光外，激发光也不进入目镜，可以使用薄的激发滤板，增强激发光的强度，压制滤板也可以很薄，因紫外光激发时，可用无色滤板（不透过紫外）而仍然产生黑暗的背景。从而增强了荧光图像的亮度和反衬度，提高了图像的质量，观察舒适，可能发现亮视野难以分辨的细微荧光颗粒。（3）相差荧光聚光器相差聚光器与相差物镜配合使用，可同时进行相差和荧光联合观察，既能看到荧光图像，又能看到相差图像，有助于荧光的定位准确。一般荧光观察很少需要这种聚光器。5）物镜各种物镜均可应用，但最好用消色差的物镜，因其自体荧光极微且透光性能（波长范围）适合于荧光。由于图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜镜口率的平方成正比，而与其放大倍数成反比，所以为了提高荧光图像的亮度，应使用镜口率大的物镜。尤其在高倍放大时其影响非常明显。因此对荧光不够强的标本，应使用镜口率大的物镜，配合以尽可能低的目镜（4×,5×，6.3×等）。6)显微照相装置要求应当是自动机型但有手动控制功能,另需具备011%或1%点测光和设有专用于荧光照相的拍摄模式,因荧光镜像的背景或物像较暗,最好配置有照明调焦标线的取景放大镜,以利于调焦。7)数字CCD相机数字CCD成像技术发展甚快,与显微镜配套使用的数字CCD相机种类较多。追求分辨率固然重要,但若获取好的显微荧光成像质量,还要考虑CCD的成像方式、灵敏度、成像速度、芯片对所用荧光素发射波长的量子利用效率等技术参数。满足一般荧光成像应采用科学级芯片,最好是冷CCD,以消除荧光成像遇到的暗流(DarkCurrent)干扰。3.分类荧光显微镜就其光路来分有两种：1）透射式荧光显微镜:激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。常用暗视野集光器，也可用普通集光器，调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上．这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱．所以对观察较大的标本材料较好。图1透射式荧光显微镜的原理2）落射式荧光显微镜这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45。角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。如换用不同的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的组合插块，可满足不同荧光反应产物的需要。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。缺点在用低倍率物镜时，像比较暗因此必须用大数值孔径的物镜，滤光镜系统必须有效地分离开激发光和荧光。图2落射式荧光显微镜的原理5.操作方法：（1）打开灯源，超高压汞灯要预热15min才能达到最亮点。（2）透射式荧光显微镜需在光源与暗视野聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的压制滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片、双色束分离器、压制滤片的插块。（3）用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。（4）放置标本片，调焦后即可观察。使用中应注意：未装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊镜油；高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需待汞灯完全冷却后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。（5）观察。例如：在荧光显微镜下用蓝紫光滤光片，观察到经0.01%吖啶橙荧光染料染色的细胞，细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光(暗绿色和橙红色)。6.注意事项：（1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。（2）应在暗室中进行检查。进入暗室后，接上电源，点燃超高压汞灯5～15min，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。（3）防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。（4）检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，超高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱；标本受紫外线照射3～5min后，荧光也明显减弱；所以，最多不得超过2～3h。（5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。天热时，应加电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时，须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。（6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。长时间的激发光照射标本，会使得荧光衰减和消失现象，故应尽可能缩短照射时间。暂时不观察时可用挡光板遮盖激发光。（7）标本观察时候应采用无荧光油，应避免眼睛直视紫外光源。（8）电源应安装稳压器，电压不稳会降低荧光灯的寿命。7.优点：1）检出能力高2）对细胞的刺激小3）能进行多重染色8.用途：1）物体构造的观察——荧光素2）荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等3）发荧光量的测定对物质定性、定量分析9.荧光显微镜的维护与保养：1．镜头的清洁镜头上粘的灰尘应用柔软的刷子轻轻刷掉，在有指纹和油污的地方宜用柔软于净的脱脂棉、纱布或擦镜纸蘸上无水乙醇(或甲醇)轻轻擦拭，对物镜表面上的油渍可以用汽油擦拭。2．涂漆部分、塑料部分的清洁对涂漆部分、塑料部分用中性去污剂擦拭，避免使用有机溶剂