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月季植物组织培养实验报告组员：张吉顺刘健喆刘建陈雪珂一、引言：植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义是指组培指用植物各部分组织，如形成层.薄壁组织.叶肉组织.胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。利用细胞的全能性，将月季的芽利用植物组织培养技术培养成植株。实验一共包括两个过程：脱分化与再分化，脱分化是将月季外植体上的芽进行培养，培养2---3周长出新芽时便能进行再分化了，再分化是诱导生根的过程。随着生物技术的迅猛发展，对月季的植物组培的研究也是越来越深入，为月季的快繁与新品种的选育提供了新的途径二、实验方法：1、MS培养基的配制MS培养基储备液的配制：MSⅠ号液50ml/LNH4NO3（mg）16500KNO319000KH2PO41700MgSO47H2O3700定容体积500mlMSⅡ号液50ml/LMnSO4H2O（mg）169ZnSO47H2O85H3BO362定容体积500mlMSШ号液50ml/LCaCl2(mg)4400定容体积500mlMSIV号液50ml/LCaCl26H2O(mg)125CuSO45H2O125Na2MO42H2O12.5KI41.5定容体积500mlMSV号液50ml/L烟酸＆VB2(mg)25VB15甘氨酸100肌醇5000定容体积500mlMSVI号液50mL/LFeSO47H2O(mg)278Na2EDTA373定容体积500ml按照上述配方，配制1L的MS培养基，注意加完上述母液，每L培养基中加入0.5mg的6--BA，5--8g琼脂，30g蔗糖，PH调至5.6---5.8。加热使琼脂完全溶解后，将琼脂倒入50个培养瓶中，每个培养瓶大约20ml左右，并用封口膜封口2、灭菌：用报纸包好2把镊子、1把手术刀和5个培养皿，和培养基一起放入高压灭菌锅中灭菌，121摄氏度灭菌30分钟。3、取材：在室外取下月季枝条，冲洗干净。将月季枝条上的刺刮掉，截取带有侧芽的幼嫩枝条，放入盛有蒸馏水的烧杯中。在超净工作台上，先用70%的酒精浸没并轻摇15秒进行预消毒，再用0.1％的HgCl2消毒10分钟。之后用蒸馏水冲洗3次。枝条截取成约5cm的带有侧芽的外植体（侧芽上端占总长三分之一，下端占总长度三分之二）4、接种：将消毒之后的外植体插入灭菌之后的培养基中，注意所有操作应在超净工作台上操作，并在火焰旁进行。注意手不能从培养皿正上方经过，应该绕过培养皿后方。在接种过程中玻璃瓶应当倒置，玻璃瓶口靠近酒精灯，用手指夹住封口膜，直到接入外植体后，盖上封口膜用绳子绑住瓶口。接种好之后放入培养室中培养。每隔3天观察一次，并记录褐化数及被污染数。继代培养：初代培养2--3周后，便可进行继代培养。选择生芽比较好的20个外植体进行继代培养。配制MS培养基时，加入琼脂糖5--8g,蔗糖30g，0.2mg的NAA.，调PH至5.6---5.8。用手术刀切切新生的侧芽接种到灭菌之后的MS培养基中，封口之后放入培养室中培养。每隔3天观察一次，并记录褐化数及污染数。6、生根培养：继代培养2---3周之后，便可进行外植体的生根培养。培制1/2的MS培养基，即每种母液的量减少一半。加完母液之后，加入5--8g琼脂粉，30g蔗糖，0.1mgNAA。调节PH至5.6至5.8。选择8个继代培养良好的外植体进行生根培养，接种到灭菌之后的1/2MS培养基中，封口之后放入培养室中培养。每隔3天观察一次，并记录褐化数及污染数。三、数据处理及分析：初代培养（50瓶）天数瓶数第1天第4天第7天第10天第13天第16天第19天第21天污染数02235666褐化数01112333出芽数010152633394141污染率=6/50=12%褐化率=3/50=6%出芽率=41/50=82%继代培养（20瓶）天数瓶数第1天第4天第7天第10天第13天第16天第19天污染数0122333褐化数0111111正常数20181717161616污染率=3/20=15%褐化率=1/20=5%正常数=16/20=80%生根培养（8瓶）天数瓶数第1天第4天第7天第10天第13天第16天第19天污染数0111111褐化数0011111生根数0004777污染率=1/8=12.5%褐化率=1/8=12.5%生根数=7/8=87.5%污染的原因有：外植体消毒不彻底，镊子或手术刀灭菌没达到要求，或者是操作过程中由于操作不当而造成杂菌进入培养瓶中。内源性的污染，外植体本身是带着病毒细菌的，可以看到霉菌是以外植体为中心长出来的。这种污染比较难以避免，只能注意取材要新鲜，外植体要健康。或者在培养基中加入适当的抗生素。褐化的原因：造成褐化的原因有很多，本质上是伤口的酚类物质被多酚氧化酶氧化为褐色的醌类物质，这种物质外流深入培养基还会抑制其它酶的活性，从而导致外植体死亡。可能导致其发生的原因一般有：外植体太老（含氧化酶多）、外植体伤口太大、消毒时间过长或是消毒液没有冲洗干净、培养温度过高、季节原因、培养时间过长等。还有在接种操作过程中，镊子和刀消毒后没有冷却完全，烫伤外植体，也可会导致褐化。由上表的数据可知，在实验过程中，从初代到生根，污染率及褐化率都较低，说明在操作过程中操作比较规范。在实验允许的范围内，能维持实验正常的进行下去，并且取得比较好的操作结果。