组氨酸代谢控制发酵

组氨酸代谢控制发酵11生工（1）班郝瑶20110801111摘要：L-组氨酸是含咪唑核的碱性氨基酸，是人体和动物体内的半必需氨基酸。L-组氨酸具有多种生理功能，应用广泛，尤其在医药领域中的应用日益受到重视，是市场上急需的氨基酸品种之一。文中简要介绍了发酵法生产L-组氨酸及产物检测方法，通过对L-组氨酸生物合成途径的分析指出了大量合成L-组氨酸的关键控制点及选育的基本思路，并重点概括了国内外对L-组氨酸高产菌株选育方案的研究。关键词：L-组氨酸；发酵；代谢途径；选育方法引言L-组氨酸（L-Histidine）化学名为L-α-氨基-β-咪唑丙酸，是分子中含有咪唑核的碱性氨基酸[1]。L-组氨酸具有多种生理功能，广泛用于医药、饲料及食品行业。尤其在医药领域的作用日益受到重视，目前，其主要应用于氨基酸输液及综合氨基酸制剂方面，已成为中国医疗最常用的药物之一，用量逐年递增。但目前L-组氨酸生产的先进技术主要掌握在欧、美、日等发达国家手里，主要采用发酵法。日本在20世纪70年代就开展发酵生产组氨酸的研究，而国内在这方面还仅处于实验室研究阶段[2-3]。因此加快研究发酵法生产L-组氨酸具有非常重要的意义。1发酵法生产L-组氨酸发酵法借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对组氨酸产生菌进行诱变，选育出营养缺陷型及组氨酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏，从而达到过量积累L-组氨酸的目的[4]。其具有原料成本低，反应条件温和极易实现大规模生产等优点，是一种非常经济有效的生产方法[5]。1.1L-组氨酸的产生菌目前发现的组氨酸产生菌有谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、枯草芽孢杆菌和粘质赛氏杆菌。已投入工业化生产的有谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌和粘质塞氏杆菌，其产酸水平分别为15.4g/L、12.5g/L和17.0g/L，糖酸转化率分别为15.4%、12.5%、10.0%[6]。1.2发酵过程中pH值的控制大部分组氨酸发酵培养基中的氮源是硫酸铵，当铵离子被利用之后，剩余的硫酸根离子会导致发酵液的pH值下降，从而对发酵产生影响。可以考虑在发酵培养基中添加碳酸钙，因为碳酸钙可以中和硫酸根离子，通过优化试验确定碳酸钙的最佳添加量。1.3生物素对L-组氨酸发酵的影响作为L-组氨酸的主要产生菌，谷氨酸棒杆菌是生物素缺陷型菌，生物素是细胞生长的必需因子，同时还是多种羧化酶的辅酶，在CO2固定反应中起重要作用，可影响糖酵解速度，改变发酵代谢流向。添加适量的生物素可以增加单磷酸己糖支路（HMP）途径的代谢流量，有利于L-组氨酸的产生[7]。1.4柠檬酸钠对L-组氨酸发酵的影响在发酵初期添加柠檬酸钠能够改变L-组氨酸生物合成途径的关键节点6-磷酸葡萄糖、丙酮酸及乙酰辅酶A的代谢流分布，保持糖酵解途径、三羧酸循环与HMP之间代谢流量平衡[8]。在发酵培养基中添加适量的柠檬酸钠后使碳架流向HMP途径，有利葡萄糖的酵解途径EMP被抑制，于组氨酸的生成[9]。影响组氨酸发酵的因素还有许多，可以通过正交试验或响应面法进行优化试验。2L-组氨酸的测定方法对L-组氨酸含量测定的研究较少，建立一种简便可行的测定方法，对组氨酸的生产具有指导意义。目前较常用的有比色法和高效液相色谱法。比色法是测定组氨酸含量的简便方法，Pauly比色法简单、快速，准确性也比较好，对仪器的要求也不高，比较适用于工业生产中组氨酸的快速测定[10]。但试验证明此法受铵离子的影响较大，铵离子与Pauly试剂反应呈黄色，会将组氨酸的橙红色覆盖掉。另外茚三酮显色-分光光度法也是一种常用的比色法，该法易于实现、精密度较好，适合在菌种选育过程中定性、定量测定发酵液中的L-组氨酸[11]。高效液相色谱法是一种准确测定的方法，一般在梯度洗脱前采用衍生试剂（如2，4-二硝基氟苯）进行柱前衍生。与比色法相比，此法的准确度和灵敏度较高，但操作比较复杂，对于样品多、工作量大的菌种筛选并不适用，所以试验中根据实际要求选择适当的测定方法。3L-组氨酸的代谢及相关途径调节组氨酸的代谢途径比较复杂，要选育组氨酸高产菌株，就必须对细胞原有的代谢途径进行改造。L-组氨酸的代谢及相关途径见附图。3.1增加前体物的合成5-磷酸核糖焦磷酸（PRPP）不仅是组氨酸的前体物也是嘌呤和嘧啶的前体物，而且ATP还直接参与组氨酸的合成，利用嘌呤的结构类似物来解除反馈调节，增加组氨酸前体物的积累。3.2增强HMP途径的流量根据EMP和HMP途径的调节得出，选育能以HMP途径上的代谢产物为碳源且生长良好的菌株可以达到增加HMP途径流量的目的。通过削弱EMP途径也能增加HMP途径的流量，进而增加组氨酸的产量。3.3阻断转酮酶由附图可知，5-磷酸核糖也是5-磷酸核糖焦磷酸PRPP）的重要来源。而PRPP是组氨酸的前体物，转酮酶酿造活性丧失，导致HMP戊糖分子重排阶段中的转酮酶催化的反应被阻断，进而大量积累5-磷酸核糖，通过选育莽草酸缺陷型突变株，可成功分离出转酮酶缺陷突变株，使得L-组氨酸产量提高[12]。3.4解除组氨酸的反馈调节在组氨酸的合成途径中，磷酸核糖-ATP焦磷酸化酶是限速酶[13]，组氨酸对其既反馈抑制又反馈阻遏，一般通过选育专属解除组氨酸对其反馈调节的结构类似物来完成；同时组氨酸对其合成途径上的其他酶也有抑制或阻遏作用，通过选育其他一些组氨酸结构类似物来逐步解除反馈调节。3.5阻断组氨酸的分解组氨酸酶又称组氨酸解氨酶，能把L-组氨酸脱氨形成尿刊酸，再通过一系列反应生成谷氨酸。选育在以组氨酸为主要或唯一氮源的基本培养基上生长微弱或不能生长的细胞，则能形成组氨酸酶缺陷型。4国内外对L-组氨酸高产菌株选育的研究通过对L-组氨酸生物合成途径的分析，了解了其育种的基本思路，介绍近年来国内外对L-组氨酸高产菌株选育的研究，希望对进一步研究有一定帮助。4.1L-组氨酸的诱变育种顾正华等[14]以谷氨酸棒杆菌ATCC13761为出发菌，经硫酸二乙酯和亚硝基胍诱变处理，获得菌株H-24，产L-组氨酸1.6g/L。此研究基于解除反馈抑制和反馈阻遏、增加前体合成与切断产物代谢途径3方面考虑，使组氨酸有较大的积累。后又经过多次诱变筛选得到多重遗传标志的菌株DH-8，产酸2.1g/L。另外选育能在D-葡萄糖酸基本培养基上生长的突变株，也能提高产酸[15]。添加柠檬酸能增加HMP途径的代谢流量，同样能提高产酸。由于芳香族氨基酸对PRPP激酶有抑制作用，可以通过筛选莽草酸缺陷型菌株来降低芳香族氨基酸的代谢流量，进而增加流向PRPP的通量。于是利用亚硝基胍诱变谷氨酸棒杆菌选育得到莽草酸缺陷型的渗漏突变株CLW0560，积累L-组氨酸达5.31g/L。如果进一步研究5L发酵罐发酵动力学及发酵条件优化，将能使组氨酸得到更大积累，对工业化生产具有重要的指导作用。曾莹等[16]对L-组氨酸选育方面也做了大量的研究，采用HNO2和紫外线复合诱变处理黄色短杆菌，选育得到一株高产菌，产L-组氨酸128.28mg/L。虽然该菌株产酸水平比较低，但可以在此基础上定向选育结构类似物抗性突变株及营养缺陷型菌株，打破代谢调节机制。利用硫酸二乙酯和亚硝基胍诱变处理谷氨酸棒杆菌S9114，最终得到一正突变株S6（D-hisr），可积累L-组氨酸327mg/L[17]。首先对其进行最佳发酵工艺的研究，确定了菌株的最佳发酵条件，继续对S6进行了一系列的诱变处理，经亚硝酸钠和紫外线复合诱变，所得菌株F6产L-组氨酸量为330mg/L。进行多次亚硝基胍的反复诱变。最终得到一株N13（MYr），可积累L-组氨酸561mg/L。虽然与张伟国等的研究相比，产酸水平较低，可能与所用出发菌的细胞特性存在差异有关，但方法仍具有很好的参考价值。可以考虑赋予菌株多重抗性，使产组氨酸更加通畅并能大量积累[18]。4.2L-组氨酸的基因工程育种随着基因工程的发展，人们开始利用其进行菌株改造，以大幅度提高组氨酸的产量。杉浦等[19]将粘质赛氏杆菌MPr90的DNA与pLG339（Kmr）相连接，用pKT1124（KmrApr）进行亚克隆获得pSS503。最后将pSS503导入组氨酸生产菌MPr90，组氨酸产量从23g/L提高为36g/L。仓桥修等[20]用亚硝基胍诱变枯草芽孢杆菌AJ11733，得19到组氨酸缺陷型菌株AJ11732。制备AJ11732的感受态细胞，从菌株AJ11733中提取DNA片段。加入到以上感受态细胞悬浊液中，培养得到组氨酸产生菌AJ11734。再从AJ11734中提取带有组氨酸合成及组氨酸抗性的遗传基因，插入原菌株AJ11733中，得到新型组氨酸产生菌AJ11735，产酸水平从11g/L提高到23g/L。5展望氨基酸输液已成为中国医疗最常用的药物之一，用量逐年增加，而L-组氨酸是氨基酸输液必不可少的氨基酸品种之一。目前急需L-组氨酸的投产并形成生产规模以加快氨基酸品种的配套工作。发酵法生产L-组氨酸的进展比较缓慢，日本于20世纪70年代中期曾进行这方面的研究，但在80年代后就未见新的报道，国内对此研究也较少，仅仅处在实验室研究阶段。近年来，随着发酵工业的发展，有关组氨酸发酵的研究又逐渐升温，人们利用代谢控制发酵理论进行工业微生物的育种工作，取得了一定进展。但组氨酸的生物合成途径比较复杂，且测定方法存在一些困难，所以寻找L-组氨酸的高产菌株是一项重要而艰巨的工作。在选育抗结构类似物时需赋予菌株多重抗性，使组氨酸积累更加舒畅。多层次多尺度的进行代谢工程研究已成为必然的发展趋势。国外利用基因工程对L-组氨酸的产生菌进行改造，大幅度提高了组氨酸的产酸水平，基因工程的引入使L-组氨酸的产量远远高于传统的诱变育种，基因工程与代谢工程相结合已成为组氨酸育种的新方向。参考文献：[1]王镜岩，朱圣庚，徐长法.生物化学[M].北京：高等教育出版社，2002.[2]林妙佳，蒙绮芳，周锡梁.组氨酸生产中间控制方法的研究[J].氨基酸和生物资源，2001，23（4）：28-31.[3]EISLERH,FROHLICHKU,HEIDENREICHE.Starvationforanessen-tialaminoacidinducesapoptosisandoxidativestressinyeast[J].ExpCellRes,2004,300:345-353.[4]宋佳，刘建成.L-组氨酸高产菌种选育及其发酵条件研究进展[J].新疆农业科学，2007，44(S2)：1-5.[8]许益清.L-组氨酸产生菌的选育及发酵条件优化[D].江南大学硕士论文，2005.[5]朱文泽，谢希贤.柠檬酸钠对L-组氨酸发酵代谢流分布的影响[J].生物技术通讯，2009，20（2202-204.[6]KROMERJO,WITTMANNC,SCHRODERH,etal.Metabolicpath-wayanalysisforrationaldesignofL-methionineproductionbyEs-cherichiacoliandCorynebacteriumglutamicum[J].MetabEng,2006,8(4):353-369.[7]PHARKYAP,BURGARDAP,MARANASCD.Exploringtheover-productionofaminoacidsusingthebileveloptimizationframeworkOptKnock[J].BiotechnolBioeng,2003,84(7):887-899.[8]朱文泽，谢希贤.柠檬酸钠对L-组氨酸发酵代谢流分布的影响[J].生物技术通讯，2009，20（2）：202-204.[9]潘军华，张星元.比色法快速测定发酵液中组氨酸[J].无锡轻工大学报，2002，21（3）：254-258.[10]卢发，张伟国.纸层析-分光光度法测定发酵液中L-丝氨酸和甘氨酸的含量[J].食品与发酵工业，2005，31（3）：119-121.[11]陈青山，张伟国.L-组氨酸产生菌的选育及其特性的初步研究[J].微生物学通报，2007，34（2）：228