组织固定液的使用

谈谈固定液的使用作者:liza3(站内联系TA)发布:2013-01-11当前，应用于固定试剂的种类较多，它们对于固定不同的组织成分起着不同的作用，因此我们在使用时应该了解不同固定剂的效能，才能合理的固定组织。根据Bencroft的分类法，将不同的固定剂分为四种类型：Ⅰ类：醛类，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。Ⅱ类：氧化剂类，四氧化锇（奥酸），高锰酸钾，重铬酸钾等。Ⅲ类：蛋白变性类，甲醇，乙醇，醋酸等。Ⅳ类：其他，氯化汞，苦味酸等。上述四种类型的固定剂，最常使用的是甲醛，其余的也在其它病理技术方面中用到。下面根据使用的需要，将着重介绍几种常用的固定剂。（1）甲醛甲醛商品名为福尔马林，一般市售的含甲醛37—40%，由甲醛气体饱和于水而成，比重为1.12。它也可以稳定的固体形式存在，它的成分为高分子量的聚合体，称为多聚甲醛。甲醛溶液较难纯化，在每批市售商品中，都含有不少的杂质如甲醇，这种在组织化学方法当中，能使酶钝化，影响其反应。甲酸，它可使固定液变酸，在陈列标本或长时间固定的组织，由于酸的作用，往往细胞核染色欠佳。甲醛有效固定作用的要点是，在蛋白质末端基团之间形成交联链。参与甲醛固定蛋白质的基团，主要为氨基，亚氨基及酰氨基，肽，胍基，羟基，SH和芳香环。甲醛与组织蛋白类的反应是多样和复杂的，因为它能和多种不同的功能基团结合，在多数情况下在其间形成桥键。甲醛有这种交联的功能，也是它的缺点，在用甲醛固定过的组织中，需要做免疫组化的，往往提倡用酶消化或热抗原修复法来使蛋白与甲醛交联的醛键断裂开，以利于后来的染色。甲醛可配成简单的或混合的固定液，最简单和最容易掌握的方法，就是取10ml甲醛液，加水90ml，这就是10%的福尔马林.当然,现在使用的固定液要求较为严格些,最好是使用缓冲福尔马林固定液,这将有利于后来的免疫组化染色的需要.从组织学的观点来说,甲醛是一种良好的固定剂,它有很多的优点:1.组织收缩较少,损伤少,保存固有物质好.2.固定均匀,穿透力强.3.能使组织硬化,增进组织弹性,有利于切片.4.能保存脂肪及脂类物质.5.成本较低.虽然甲醛有上述的优点,但这都是相对而言,任何物质都不可能十全十美的,它也有许多缺点:1.杂质含量较多,如甲醇,可钝化酶类,影响反应.2.含有微量甲酸,导致固定液酸变,影响染色.3.可产生福尔马林色素,影响观察.4.不能固定尿酸和糖类物质.5.容易挥发,污染环境,可导致标本干涸.6.可长期存在于固定过的组织上.有人做过实验,组织用甲醛固定后在流水中冲洗5小时后,仍留有相当多的甲醛与蛋白质相结合,但需要经过长时间的流水冲洗(24天的冲洗)方能除去.可见存在于组织上的甲醛是不可能除去的.因为临床活检不可能有这么长的时间来冲洗组织.因此要特别指出的是,在其后的各种技术操作中,要特别注意到甲醛的存在,必须要想办法除去它,否则将会给各种染色造成影响,甚至导致失败。应用甲醛,可以配成许多种固定液:1.10%缓冲福尔马林固定液甲醛100ml蒸馏水900mlNaH2PO44gNa2HPO46.5g该固定液是当今流行的固定液,因它对组织固定较好,损伤较少,因对其后的各方面的研究都较好,尤其是对免疫组化的染色.2、10%福尔马林固定液甲醛100ml自来水900ml这是一种最简单的固定液，适合于边远地区携带的固定液，但由于它的单一性，因此，只要有条件的单位都不要求使用这种固定液。3、10%福尔马林盐固定液甲醛100ml自来水900mlNacl9克先将Nacl溶于水，再加入甲醛。这也是一种较为简单的固定液，但由于加入Nacl，它是一种重金属盐物质，加入了它可促进和改善染色，增加染色的强度。4、Bouin氏固定液苦味酸饱和水溶液75ml甲醛2ml冰醋酸5ml该固定液中的冰醋酸，对胶原纤维等组织有膨胀作用。而甲醛对组织有收缩作用。两种试剂的混合使用，用以抵消彼此间的副作用。使组织固定达到优良的固定水平。5．醛糖钙固定液甲醛100ml蔗糖300ml乙酸钙20g蒸镏水90ml先将蔗糖和乙酸钙溶于蒸镏水，后加入甲醛。该固定液对于做酶的组织化学的研究效果较好，组织固定后，做冰冻切片，再给予显示。当前国内外基本上都还是要用甲醛来固定组织。从免疫组织化学的角度来说，甲醛固定的组织大部分都可以用免疫组化的手段来检测，据多人认为，它对IgA，IgM，J链，K链和λ链的标记效果较好，且背景清晰。但美中不足的是：经它固定的组织，可与蛋白形成醛交联蛋白，这种醛键可封闭抗原。固此，在免疫组化实际检测中，应根据不同的要求和需要，采用酶消化或者其它抗原修复如微波、高压等的方法，以便破坏醛键重新暴露抗原。（2）酒精：又称乙醇，为无色透明的液体，沸点是78度，工业酒精是95%。酒精它有许多优点：1、可保存尿酸结晶和糖原等物质。高浓度的酒精如95%，无水酒精可保存上述两种物质，因它们易溶于水，因此，要证明上述两种物质的存在，就不能用含水的固定液来固定组织。2、能在任何比例的情况下与水混合，在病理技术中，酒精是一种十分重要的试剂，它起着关键的作用。如果没有酒精，将会无法完成必要的工作。如组织的脱水，切片染色前后都离不开酒精，在常规的工作中，通常都用95%的工业酒精来配成60%、70%、80%、90%等不同的浓度来使用。3、可溶解苯类物质为染色步骤中的桥梁试剂。常规活检等切片上的石蜡必须除去，才能进行染色，能除去石蜡的物质有苯及汽油等，常用的有苯类试剂，苯不溶于水，但能溶于酒精，酒精在这里充担着除去苯和连接水的作用，为切片入水架起了桥梁，因此称它为桥梁试剂。4、能除去切片上的水份，使切片无水化。切片经染色后，由于所用的试剂都为水溶液，因此在切片上含有大量的水份，这些水份经系列梯度酒精的置换吸附后，到无水酒精中已完全无水，这样处理对于切片的保存是有好处的，否则，切片将会褪色。5、可用来保存标本。大体标本经福尔马林固定后，如为了陈列保存，必须取出冲冼。然后移入75%的酒精中。如果用福尔马林作陈列标本的固定液，则因为福尔马林含有杂质较多，液体容易酸化，时间一长，会逐渐变为微黄*色或淡黄*色，影响美观，影响陈列的效果。6、可与其它试剂配成多种的混合固定液，有时为了加快固定，常采用酒精和其它试剂来配成混合固定液，这种固定液在固定的同时，兼有对组织脱水的作用。应用酒精配成的混合固定液有：①Carnoy氏固定液氯仿300ml冰醋酸100ml95%酒精600ml该固定液固定组织快速，在固定的同时兼有脱水的作用。溶液中的氯仿和酒精，对组织的收缩较厉害，但应用了冰醋酸，这种现象便被中和去。②AF固定液甲醛100ml冰醋酸50ml95%酒精850ml这种固定液的作用与上液有相似之处，但要注意的是，凡使用含有醋酸的固定液，其脱水用具不能使用铜制的脱水盒，因冰醋酸跟铜离子起反应，生成醋酸铜，这种物质可沉淀于组织间，可破坏组织中的抗原，造成免疫组化检测的失败。应用时应多加注意。酒精也有许多不足之处，它的缺点是：1、可溶解脂类物质，凡要证明组织是否含有脂类和类脂物时，切不能用含有酒精的固定液去固定组织，也不能用石蜡切片，因为酒精可将它们溶解去，而石蜡切片组织中含有的脂类物质，则在组织脱水时被溶解去，只留下脂类或类脂物所占有的空间。2、对组织收缩较大，不宜作单纯固定液。高浓度的酒精，对组织有显著的收缩作用，造成组织发硬易脆，难以切片等现象。因此，它不作为单纯的固定液。3、渗透力不强。当用酒精固定组织时，组织表面很快就被固定，并形成了一层蛋白膜，这层膜可阻挡固定液向里渗透，造成了中间组织固定不佳的现象。4、可沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，凡经酒精固定的组织，核的染色都不好。5、可脱去切片上已着染的各种颜色，切片经染色后，一是必须洗去多余的染液，二是必须脱去切片上的水。在用酒精洗切片时，必须仔细地掌握显微镜下观察，还要掌握酒精的浓度，低浓底的酒精脱色力强，稍不注意，便可脱去切片上大部分的颜色。切片脱水时，要较快地通过低浓度的酒精，以免使已着染的颜色被脱去。6、价格较贵。从经济学的角度，应用酒精固定组织划不来，例如：一瓶500ml的甲醛，可配成500ml的固定液，按每例标本需要100ml计，可固定50例标本，而一瓶500ml的酒精，即使配成80%酒精，也只能固定6例标本，因此，若用酒精固定组织，其价格比用甲醛固定组织的要高8倍。（3）冰醋酸。冰醋酸为无色透明的液体，易挥发，气味大，一打开瓶盖，整个文章都可闻其味道，纯醋酸在17℃时常为结晶状，因称为冰醋酸，在冬天使用时，可用微波炉进行解冻，再行使用，它的优点有：1、能迅速固定染色质，助于染色，用醋酸配成的固定液，其作用快，固定效果均匀，对于染色质的固定快，因此，用其作固定的切片染色好，在配其它染色液如明矾苏木素和伊红时，常常需加入一定量的醋酸，以促进染色。2、能使组织尤其是富含纤维的组织膨胀。各种固定液对组织都有收缩的作用，尤其是对富含纤维的组织。而它不但不会使组织收缩，而且还会令许多组织发生膨胀的作用。根据这个特点，用它配成许多种不同的混合固定液，以达到固定好，收缩少，易切片，效果好等目的。用它配成的混合固定液有：（1）Zenker氏固定液：重铬酸钾25G升汞50G蒸馏水1000ml冰醋酸50ml先将重铬酸钾和升汞溶于水中，尢其是重铬酸钾，应用热水或加温的方法将其溶解，然后过滤贮存于带盖的玻璃瓶中，如暴露于空气中，该溶液将会被慢慢氧化而便颜色加深，导致失效。临用时，取贮存液950ml，加入50ml的冰醋酸，即可使用。应用该固定液固定的组织，一般不要超过24h，取出组织，流水冲冼12小时以上，然后保存于75%-80%的酒精中，在切片染色前，必须用碘除去汞盐的沉着。应用该固定液的组织，细胞核及细胞浆染色十分清晰，特别是要显示骨骼肌的横纹时，应用本液可获得满意的结果，但由于其含有醋酸，故不能用于保存细胞颗粒，红细胞及含铁血黄素。（2）Flemming氏液2%酸水溶液200ml1%铬酸水溶液700ml冰醋酸100ml该液中的奥酸对脂肪组织既有固定作用，又有染色作用，对有髓神经纤维也有固定兼染髓鞘的作用。如果做HE的染色，该液不适合。应用该液固定的组织，切片不能太大过厚，一般1-2毫米厚固定时间1-3天，后经水洗，保存于80%酒精中，除上述两液体外，还有Bouin氏液和Carnoy氏液等。冰醋酸也有许多不足之处：1、不能作为单一的固定剂。冰醋酸在实际应用中，常被作为添加剂来使用，如许多种固定液，都加入了冰醋酸。另外，在苏木素和伊红染液中，也常加入了冰醋酸。2、不能凝固蛋白质，不能保存白细胞颗粒，红细胞及含血铁黄素等。3、价格较贵。(4)重铬酸钾是一种固体，粉末状，桔红色，具有毒性，较难溶解于凉水，因此在配制时用较高温度的水来溶解，也较易发生沉淀。它的优点是：1、能固定脂肪及类脂物。2、为髓鞘及嗜铬细胞优良的媒染剂。3、可配成多种的混合固定液（1）Helly氏液重铬酸钾25g升汞50g蒸馏水1000ml甲醛50ml临用时加入甲醛，因其加入后于24小时后可发生沉淀而失效，因用时应特别注意。该液是白细胞颗粒的优良固定剂，因此凡为白细胞或造血器官如骨髓，脾脏及患先天性梅毒之肝脏等，可用此液固定。此液原配方要求加入硫酸钠，但据我们经验认为，硫酸钠在液中对组织无任何作用，故省去。（2）Orth氏液重铬酸钾20g蒸馏水1000ml甲醛100ml该液固定组织较缓慢，不适合于作临床的活检固定液，4毫米厚的组织固定时间需36-72小时，该液对于染色质的固定好，显示清晰，但可溶解部分红细胞和含铁血黄素。重铬酸钾的不足之处有：1、不能沉淀蛋白质，它必须和醋酸配成混合固定液，方能发挥作用，产生铬酸，沉淀蛋白质。2、具有毒性及产生高温。在配制液体时，如清洗剂，当加入硫酸时，可产生很高的温度，并挥发出刺鼻的气体，应特别注意。3、它不能长期固定组织，经它固定的组织应充分水洗后保存于80%酒精中。（六）氯化汞又称升汞，具有毒性。单独用于固定组织，对组织有较大的收缩力，故很少单独使用。它可使组织蛋白凝固，迅速硬化而形成白色硬膜，这是由于它穿透力极弱所致，因此它不适合固