药学-分子生物学资料.

第三章转录及其调控DNARNA蛋白质复制转录翻译逆转录RNA复制一、基本概念生物体以DNA为模板合成RNA的过程。转录RNADNA转录(transcription)：参与转录的物质原料:NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:RNA聚合酶其他蛋白质因子RNA合成方向：5'3'RNA链的延伸图解3´5´RNA-DNA杂交螺旋聚合酶的移动方向新生RNA复链解链编码链（反义链）模板链（有意义链）延长部位转录空泡(transcriptionbubble)：第一节原核生物转录•DNA聚合酶在启动DNA链延长时需要引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接启动RNA链的延长。•原核生物RNA聚合酶能直接与模板DNA的启动序列结合而启动转录。一、原核生物转录酶及相关因子（一）原核生物RNA聚合酶●原核生物RNA聚合酶（大肠杆菌为例）全酶=核心酶+σ因子βασωαβ’图12-5E.coliRNA聚合酶的亚基组成大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析亚基基因相对分子量亚基数组分功能αrpoA365002核心酶决定哪些基因被转录βrpoB1510001核心酶β和β'共同形成RNA合成的活性中心β'rpoC1550001核心酶ω？110001核心酶？σrpoD700001σ因子存在多种σ因子，辨认起始位点辨认典型转录起始点的蛋白质σ32σ70辨认热休克基因起始点的蛋白质σ的作用负责模板链的选择和转录的起始它是酶的别构效应物，可以极大的提高RNA聚合酶对启动子区DNA序列的亲和力。在某些细菌内含有能识别不同启动子的σ因子，以适应不同生长阶段的要求，调控不同基因转录的起始。如大肠杆菌：•原核生物RNA聚合酶的活性，可被某些抗生素特异性的抑制。•如抗结核分枝杆菌药物利福平或利福霉素专一性的结合β亚基。•ρ因子是由相同亚基组成的六聚体蛋白质，亚基分子量46kD。•ρ因子能结合RNA，又以对polyC的结合力最强。•ρ因子还有ATP酶活性和解链酶(helicase)的活性。（二）原核生物转录相关因子1.ρ因子：•2.其他因子还有一些蛋白参与、调节转录终止。如nusA蛋白协助RNA聚合酶识别某些特征性的终止位点。他们的共性是：所识别的终止信号位于新合成的RNA分子中，而并非在DNA模板上。二、原核生物转录过程•转录的起始（模板识别、转录起始）•转录的延伸•转录的终止5335结构基因调控序列RNA-polRNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启动子(promoter)。是控制转录的关键部位。1.模板的识别：RNA聚合酶全酶结合到DNA的启动子上启动转录（一）原核生物的转录起始：●原核生物启动子结构Pribnow41-44bp大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区T85T83G81A61C69A52T89A89T50A65A100编码链AACTGTATATTA模板链TTGACATATAAT3’5’DNA转录起始点Probnow盒子启动子3510+1转录区5’3’RNA转录起点与新生RNA链第一个核甘酸相对应DNA链上的碱基。TTGACA区：提供了RNA聚合酶全酶识别的信号Probnow盒子：酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）原核典型启动子的结构-35-10转录起点TTGACA16-19bpTATAAT5-9bp2.DNA双链局部解开1.RNA聚合酶与模板结合。3.在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物：5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+ppi转录起始过程：2.原核生物转录起始过程：（二）原核生物转录延长●（大肠杆菌）亚基脱落，RNA–pol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；●在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPiRNA链的延伸图解3´5´RNA-DNA杂交螺旋聚合酶的移动方向新生RNA复链解链编码链（反义链）模板链（有意义链）延长部位转录空泡(transcriptionbubble)：53DNA原核生物转录过程中mRNA的羽毛状现象核糖体RNARNA聚合酶在同一DNA模板上，有多个转录同时在进行；mRNA转录尚未完成，翻译已在进行。这种形状说明：•依赖Rho因子的转录终止•非依赖Rho因子的转录终止转录终止指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。原核生物（大肠杆菌）依据是否需要蛋白质因子的参与，转录终止分为：（三）原核生物转录终止1.依赖ρ因子的转录终止1.Rho因子与RNA转录产物结合后，ρ因子和RNA聚合酶均发生构象变化2.解螺旋酶活性使DNA/RNA杂化双链拆离2.非依赖因子的终止（强终止子－内部终止子）终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，RNA形成发夹结构；在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列，RNA的3’端为寡聚U5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`RNA5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTT...3DNAUUUU...…UUUU...…5`UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU...3`茎环(stem-loop)/发夹(hairpin)结构发夹式结构和寡聚U的共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。茎环结构使转录终止的机理茎环结构使RNA聚合酶变构，转录停顿；DNA和RNA都要各自形成双链，使转录复合物趋于解离，RNA产物3端多个连续的U，促进RNA产物从模板链脱落。5´pppG5335RNA-pol终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，长度效率真核生物原核生物第二节真核生物转录（一）真核生物RNA聚合酶酶位置转录产物相对活性对α-鹅膏蕈碱的敏感性RNA聚合酶Ⅰ核仁45S-rRNA50-70%不敏感RNA聚合酶Ⅱ核质hnRNA20-40%敏感RNA聚合酶Ⅲ核质tRNA、5S-rRNA、snRNA约10%存在物种特异性真核细胞的三种RNA聚合酶特征比较一、真核生物转录酶及相关因子•真核生物RNA聚合酶的结构比原核生物复杂，所有真核生物的RNA聚合酶都有两个不同的大亚基和十几个小亚基。•RNA聚合酶Ⅱ由12个亚基组成，其最大的亚基称为RBP1。•RNA聚合酶Ⅱ最大亚基的羧基末端有一段共有序列(consensussequence)以羟基氨基酸为主体组成的重复序列(YSPTSPS)n，称为羧基末端结构域(carboxyl-terminaldomain,CTD)。CTD对于维持细胞的活性是必需的。（二）真核生物转录相关因子能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质，现已发现数百种，统称为反式作用因子(trans-actingfactors)。反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的，则称为转录因子(transcriptionalfactors,TF)。1.转录因子参与RNA-polⅡ转录的TFⅡ蛋白激酶活性，使CTD磷酸化TFⅡHATPase57（）34（）TFⅡE解螺旋酶30，74TFⅡF促进RNA-polⅡ结合及作为其他因子结合的桥梁33TFⅡB稳定TFⅡD-DNA复合物12，19，35TFⅡA辅助TBP-DNA结合TAF**结合TATA盒TBP*38TFⅡD功能亚基组成，分子量(kD)转录因子蛋白激酶活性，使CTD磷酸化TFⅡHATPase57（）34（）TFⅡE解螺旋酶30，74TFⅡF促进RNA-polⅡ结合及作为其他因子结合的桥梁33TFⅡB稳定TFⅡD-DNA复合物12，19，35TFⅡA辅助TBP-DNA结合TAF**结合TATA盒TBP*38TFⅡD功能亚基组成，分子量(kD)转录因子•RNA聚合酶II与启动子的结合、启动转录需要多种蛋白质因子的协同作用。通常包括：可诱导因子或上游因子与增强子或启动子上游元件的结合；通用转录因子在启动子处的组装；辅激活因子和/或中介子在通用转录因子/RNA聚合酶II复合物与可诱导因子、上游因子之间的辅助和中介作用。因子和因子之间互相辨认、结合，以准确地控制基因是否转录、何时转录。•为了保证转录的准确性，不同基因需不同转录因子。•拼板理论(piecingtheory)：少数几个反式作用因子（主要是可诱导因子和上游因子）之间互相作用，再与基本转录因子、RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。可诱导因子和上游因子常常通过辅激活因子或中介子与基本转录因子、RNA聚合酶结合，但有时也可直接与基本转录因子、RNA聚合酶结合。二、真核生物的转录过程真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子，形成转录起始复合物(pre-initiationcomplex,PIC)。真核生物的转录终止过程也不相同。POL-ⅡTFⅡFⅡAⅡB（一）真核生物转录起始POL-ⅡTFⅡFⅡHⅡETBPTAFTFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA复合物TATAⅡAⅡBTBPTAFTATAⅡHⅡECTD-PPIC组装完成，TFⅡH使CTD磷酸化PIC的形成TFⅡH使CTD磷酸化二、真核生物转录延长真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。RNA-pol前移处处都遇上核小体。转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。核小体移位用含核小体结构的DNA片断作模板，具备酶、底物及合适反应条件下进行转录。转录中以DNA酶水解法去检测，从DNA电泳图象观察，能保持约200bp及其倍数的电泳条带。核小体解聚组蛋白中含量丰富的精氨酸发生了乙酰化，正电荷降低；DNA分子中AMP—ADP—聚ADP，负电荷减少。而核小体组蛋白－DNA是靠碱性氨基酸提供正电荷和核苷酸磷酸根上的负电荷来维系的。RNA-PolRNA-PolRNA-Pol核小体转录延长中的核小体移位转录方向（三）真核生物转录终止真核生物的转录终止，是和转录后修饰密切相关的。真核生物mRNA有聚腺苷酸(polyA)尾巴结构，是转录后才加进去的。转录不是在polyA的位置上终止，而是超出数百个乃至上千个核苷酸后才停顿。已发现，在读码框架的下游，常有一组共同序列AATAAA，再下游还有相当多的GT序列。这些序列称为转录终止的修饰点。转录越过修饰点后，mRNA在修饰点处被切断，随即加入polyA尾巴及5’帽子结构。下游的RNA虽然继续转录，但很快被RNA酶降解。核酸酶RNA-polAATAAAGTGTGTG转录终止的修饰点55333加尾AAAAAAA······3hnRNA转录终止修饰点：AATAAA及相当多的GT序列。•起始：真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。转录起始前复合物(PIC)的组装。•延长：类似原核生物。（核小体移位和解聚）•终止：与转录后修饰有关，转录终止修饰点切断加尾。真核生物转录过程：•真核生物转录生成的RNA分子是初级RNA转录物(primaryRNAtranscript)，几乎所有的初级RNA转录物都要经过加工，才能成为具有功能的成熟的RNA。•加工主要在细胞核中进行。三、真核生物RNA成熟hnRNA:核内的初级mRNA称为杂化核RNA或非均一核RNA(heterogeneousnuclearRNA)分子量比mRNA大几倍、几十倍；核酸序列实验mRNA来自hnRNA，但去掉中间相当部分片段；核酸杂交实验hnRNA与DNA模板完全配对,mRNA与DNA模板部分配对。1.mRNA的剪接真核生物的结构基因由若干编码区和非编码区相间排列而成，因编码区不连续，称断裂基因。断裂基因(splitegene)CABD编码区