药学分子生物学

刘汝川特制，版权所有，拒绝盗版刘汝川特制，版权所有，拒绝盗版1第一章基因与基因组基因(gene)：是指合成有功能的蛋白质、多肽或RNA所需的全部DNA序列（除部分病毒RNA），是基因组的一个功能单位。基因组（genome）：是指生物体一套完整的单倍体遗传信息的总和，包括所有基因和基因间的区域。基因组的主要功能是贮存和表达遗传信息，是物种及其个体之间区别和联系的最本质生物学特征。基因组学（genomics）：是研究生物基因组的结构、功能及表达调控的一门科学。调控序列（顺式作用元件）：一个基因的调控区和其结构基因位于同一个DNA分子的相邻部位，这种调节方式称为顺式调节，相应的DNA序列成为顺式作用元件。（1）启动子：RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。（2）增强子：能强化转录起始的一段DNA序列。（3）沉默子（4）终止子。反式作用因子：通过识别或结合顺式作用元件上的核心序列从而参与调控基因转录的蛋白质。也称转录因子。原核生物基因组结构特点:1.具有类核结构2.以操纵子为功能单位/多顺反子mRNA3.结构基因大多为单拷贝，编码序列一般不重叠4.结构基因大多没有内含子5.非编码序列比例约为一半6.含可移动DNA序列操纵子（operon）操纵子是原核生物的一段DNA序列，由几个串联排列的功能相关的结构基因，加上调节序列组成的一个完整的连续的功能单位。操纵子结构通常与启动子区域有部分重叠，可通过代谢物与调节蛋白相互作用而激活或抑制基因转录，这是原核生物最常见的转录调节方式。真核生物基因组结构特点1.基因组庞大，为线状双链DNA2.断裂基因3.非编码区与单顺反子4.大量重复序列5.基因家族与假基因断裂基因（splitgene）:真核生物结构基因由外显子与内含子间隔排列，内含子在转录后被剪切掉。基因家族（multigenefamily）：是来源相同，结构相似，功能相关的一组基因，由某一共同祖先基因经重复和突变产生。假基因（pseudogene）：与具正常功能基因序列相似，但无转录功能或其转录产物无功能的基因。人类基因组计划（HGP）HGP的主要目标:•遗传图谱：基因或DNA标记在染色体的相对位置与遗传距离。•物理图谱：一级结构上两个DNA片段之间的实际距离。•序列图谱：基因组DNA的全部核苷酸序列。•转录图谱：正常或受控条件全基因表达的时空图。刘汝川特制，版权所有，拒绝盗版刘汝川特制，版权所有，拒绝盗版2HGP的意义:•鉴定人类全部基因，推动生物技术发展。•理解疾病与基因的关系。•推动模式生物研究。•促进多学科发展与交叉融合。不同生物基因组结构特点：病毒原核生物真核生物基因组较小，只含一种核酸（DNA或RNA）具有类核结构、通常一条环状双链DNA分子（基因组、质粒DNA）基因组庞大，为多条线状双链DNA（细胞核、细胞器DNA）含有重叠基因以操纵子为功能单位（多顺反子mRNA）断裂基因存在转录单元结构基因大多为单拷贝，编码序列一般不重叠非编码区远多于编码区单顺反子噬菌体基因连续，感染真核细胞的病毒基因不连续结构基因大多没有内含子、是连续的存在大量重复序列编码序列占绝大部分非编码序列比例约为一半基因家族与假基因主要为单拷贝序列（反转录病毒含有两个拷贝）含可移动DNA序列（转座子）DNA末端具有端粒结构蛋白质组（proteome）：一个细胞、一个组织或者一个有机体的基因组表达的所有蛋白质。蛋白质组学（proteomics）：阐明生物体各种生物基因组在细胞中表达的全部蛋白质的表达模式及功能模式的学科。第二章PCR、核酸杂交、基因芯片PCR基本原理：以待扩增的DNA为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶作用下，以dNTP为底物，按照半保留复制的原理，通过变性、退火、延伸三个步骤完成新的DNA合成，并反复重复这一过程。PCR反应步骤：高温变性：94℃获单链模板低温退火：55℃引物结合单链模板适温延伸：72℃DNA新链合成PCR反应体系：DNA模板、引物（决定PCR反应特异性）、耐热DNA聚合酶、dNTP、缓冲体系一、二价阳离子PCR与DNA复制的比较：相同点：DNA合成反应DNA聚合酶参与需要引物4种dNTP为原料不同点：体外反应仅合成特定DNA片段（由1对引物限定）变温条件下进行刘汝川特制，版权所有，拒绝盗版刘汝川特制，版权所有，拒绝盗版3仅一种耐热的DNA聚合酶参与DNA引物循环多次PCR反应体系的优化：特异性、有效性、忠实性1、DNA聚合酶：耐高温、保真性、激活剂2、模板DNA：种类、用量、质量3、dNTP:浓度一致、稳定4、DNA引物：决定PCR扩增产物的特异性和长度。引物设计一般遵循的原则：长度；碱基随机分布；避免引物间、引物自身互补；引物的3’端不能修饰、不应错配；两条引物之间退火温度不大于5oC。PCR技术的应用1)基因克隆2)基因检测(1)PCR产物的限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP)基因突变会导致基因序列中产生新的限制性核酸内切酶位点或使原有限制性核酸内切酶位点消失。因此，突变基因经相应的限制性核酸内切酶水解后，其电泳条带的数量和大小就会发生改变，根据这些改变可以判断突变是否存在，即限制性片段长度多态性技术。(2)PCR产物的单链构象多态性分析(PCR-SSCP)基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链DNA由于碱基组成或排列顺序不同，形成不同的构象。利用PCR扩增目的基因片段，通过变性成为单链，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸的改变会造成单链DNA片段构象的改变，其迁移率随之改变，从而检测基因的突变。(3)PCR产物的等位基因特异性寡核苷酸探针杂交(PCR-ASO)采用PCR扩增受检者基因的目标片段，并与相应的ASO探针杂交。针对已知突变位点的基因，设计一对寡核苷酸探针，其中一条为野生型探针（N），与正常序列互补，另一个为突变型探针（M），突变碱基应位于探针的中央，与突变序列互补。PCR衍生技术（一）巢式PCR（二）逆转录PCR(RT-PCR)先将RNA用反转录酶反转录成cDNA，然后再加入特异引物对目标片段进行扩增，扩增产物的分析与普通PCR类似。反转录酶：AMV和MoMLV反转录酶反转录引物：随机引物、Oligo(dT)、特异性引物用途：检测基因表达水平；检测RNA病毒（三）多重PCR在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同的DNA片段的方法。优点：多个致病基因同时检测。（四）定量PCR实时荧光定量PCR在PCR反应体系中加入反应PCR扩增进程的荧光染料或荧光标记探针，实时监测PCR过程中荧光信号的变化，通过参照基因或标准曲线对起始模板DNA的浓度进行精确定量分析。实时荧光定量PCR原理刘汝川特制，版权所有，拒绝盗版刘汝川特制，版权所有，拒绝盗版4如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析三个基本概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度荧光染料：SYBRGreenI核酸分子杂交原理：核酸变性与复性核酸分子杂交技术用标记的已知序列的核酸片段（探针）来检测样品中未知核酸序列（形成异源杂交体），再经显影或显色的方法，将结合的核酸的位置或大小显示出来。核酸探针（probe）能与待测的靶核酸序列特异性互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记的核酸片段。核酸探针类型DNA探针：基因组DNA探针；cDNA探针；寡核苷酸探针RNA探针核酸探针标记物放射性标记物：32P,3H,35S灵敏度高;但存在环境污染和半衰期短等缺点。非放射性标记物:生物素、光敏生物素、地高辛、酶、荧光素等，但灵敏度和特异性较放射性标记物差。核酸分子杂交技术应用固相杂交印迹杂交(blottinghybridization)：Southernblot、Northernblot斑点杂交(dothybridization)原位杂交(insituhybridization)液相杂交印迹杂交的一般步骤：1.样品制备和电泳分离2.样品变性处理、转印3.探针制备和标记4.预杂交与杂交5.洗去未杂交的游离探针6.检测杂交信号7.结果判断与分析印迹技术（blotting）将核酸或蛋白质等生物大分子通过一定方式转移并固定到固相支持物上以便进一步分析的方法。1.Southernblot(DNA检测)通过核酸内切酶降解样品中DNA，再经凝胶电泳分离，将分离后的DNA片段从凝胶转移到吸附薄膜上并固定，随后用标记的探针进行杂交，以检测目的DNA。刘汝川特制，版权所有，拒绝盗版刘汝川特制，版权所有，拒绝盗版5步骤：1.DNA片段分离变性2.DNA片段转移与固定3.杂交反应4.杂交信号检测2.Northernblot（RNA检测）RNA经变性凝胶电泳分离后，转移固定到固相支持物上，与标记的探针杂交并检测。（分析基因的转录和mRNA分子的大小）。3.Westernblot（蛋白检测）基本原理：通过电泳区分不同的蛋白组分，并转移至固相支持物，通过特异性抗体作为探针，对靶蛋白（抗原）进行检测。也称为免疫印迹（immunoblotting）。主要用途：1.鉴定蛋白质表达情况2.比较不同样本中特定蛋白质相对表达量3.分析蛋白-蛋白间相互作用(蛋白质组学研究)三种印迹技术的共同点基本步骤相同（电泳、转印、杂交反应、杂交信号检测）三种印迹技术的不同点SouthernBlotNorthernBlotWesternBlot检测对象DNARNA蛋白质凝胶种类琼脂糖琼脂糖聚丙烯酰胺预处理（变性剂）限制性酶切NaOH甲醛热变性SDS检测探针DNAcDNA抗体原位杂交：在保持细胞形态的条件下，检测与探针互补的核酸序列在细胞内的空间位置。荧光原位杂交采用荧光标记的探针与待测样本中的核酸进行原位杂交，从而检测核酸序列在组织或细胞中的定性、定位及相对定量。遗传性疾病的产前诊断荧光原位杂交筛选21三体（间期）FISH检测白血病细胞BCR-ABL融合基因荧光原位杂交检测上皮细胞中人乳头瘤病毒的感染基因芯片(genechip)•将大量探针有序排列于固相支持物表面或直接在固相支持物上原位合成探针，然后与标记的待测核酸样品进行杂交，通过对探针分子杂交信号强度的分析来获知样品中相应分子的数量和序列信息。•由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为基因芯片。蛋白质芯片•高通量的蛋白质功能分析技术，用于分析蛋白质表达谱，研究蛋白质间或蛋白质与其他分子间相互作用，筛选药物作用蛋白靶点。•基本原理：将各种蛋白质有序地固定于载体上成为检测用的芯片，然后用标记的蛋白质或其他成分与芯片作用，洗去未结合的成分，再利用扫描技术测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白质间或蛋白质与其他分子之间的相互作用关系。三、基因克隆、表达和调控基因克隆五个基本部分：一、目的DNA的分离获取（分）；二、载体的选择与限制酶切（切）；三、目的DNA与载体连接（连）；刘汝川特制，版权所有，拒绝盗版刘汝川特制，版权所有，拒绝盗版6四、重组DNA转入受体细胞（转）；五、重组体的筛选与鉴定（筛）。（一）目的基因的获得①化学合成②基因组文库与cDNA文库：包含全面的基因和mRNA信息基因组文库（genomiclibrary，G-文库）是指含有某种生物全部基因随机片段的重组DNA克隆群。cDNA文库（cDNAlibrary，C-文库）以细胞全部mRNA经逆转录，制备出全套的cDNA克隆集合。③利用PCR及RT-PCR扩增技术合成序列已知的基因④其它技术（二）目的基因与表达载体的重组载体（vector）：携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。按功能分：克隆载体；表达载体多克隆位点（MCS）：一段人工合成的DNA序列，含有密集排列的多种限制性内切酶识别序列，以便不同来源的外源DNA片段插入载体。1.限制性核酸内切酶识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的一类核酸内切酶，为原核生物所特有。分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类基因工程技术中常用的是Ⅱ类（分子剪刀），识别位点与切割位点序列特异，且在识别序列内切割