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1细胞培养：从活的机体中取出组织或细胞，分散成单个细胞，模拟机体内的生长条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使其在体外环境中继续生长繁殖的过程，并维持其结构和功能的技术。2净化工作间设计标准为万级3消毒：杀死病原微生物，但不一定能杀死细菌芽孢的方法，通常用化学的方法来达到消毒的作用，用于消毒的化学药物叫做消毒剂。4灭菌：把物理上所有的微生物全部杀死的方法，通常用物理的方法来到达灭菌的目的。5贴壁依赖型细胞分为4型：成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型、多型细胞型6传代培养：体外生长的培养细胞受营养条件、生长空间等因素的限制，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新培养液进行扩大培养的过程。7细胞活力：活细胞占总细胞的百分比8冻存和复苏的原则：慢冻快融9细胞冻存常用保护剂为DMSO，它是一种渗透性保护剂10细胞污染和检测方法：肉眼直接观察法、培养检查法、显微镜观察法、PCR检测11支原体污染的处理：用MRA处理细胞、清洗纯化法、药物辅助加温处理、使用支原体特异性血清12原代培养：从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，完成了从体内环境到体外环境的过渡和适应过程，恢复了分裂增殖和生长发育的能力13实体组织形成细胞悬液的方法：机械分散法、消化分离法（上皮细胞和肝细胞）、贴块培养法（血管平滑肌细胞）14悬浮细胞分离方法（淋巴细胞）：密度梯度离心15原代细胞的纯化：自然纯化和人工纯化（酶消化法、反复贴壁法、培养及限定方法、流式分选）16动物细胞大规模培养方式：分批式培养、流加式培养、半连续式培养、连续式培养17流式细胞术：高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或颗粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞进行快速多参数定性或定量检测和分选的一种细胞分析技术。18流式细胞仪：以流式细胞术为理论基础，是集流体力学、激光技术、电子工程学、单克隆抗体技术、细胞荧光化学和计算机等学科知识为一体的高科技细胞分析仪。19流式细胞仪特点：单个细胞分析、同时多参数分析、速度快（10000个/S）、统计学意义（提供细胞群体的均值和分布情况）、分选感兴趣的细胞20流式细胞术对照的设置：空白对照（自发荧光/本底荧光）：未染色细胞同型/独特型对照：抗原抗体之间是否特异性结合，排除非特异结合补偿对照：多色分析时做每种荧光素单独染色的细胞阳性对照：确定操作过程的正确性21荧光补偿：利用电子技术活计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术22流式细胞仪数据显示方式：单参数直方图、双参数二维点图、等高线图、密度图23细胞增殖检测技术：直接计数：优点：不需要特定的试剂和仪器、准确。缺点：不适合样品数量多的情况、不适合评估特定的亚群胸腺嘧啶核苷掺入法（3H—TdR）：优点：敏感性高、客观性好、重复性好。缺点：但需要一定设备条件，存在放射性核素污染的问题5溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）检测法：优点：不仅能用于体外实验，还能用于活体实验。缺点：Brdu需要变性DNA后才能与抗体结合，破坏DNA双链结构，影响其它染料结合染色，导致染色弥散，准确性降低等问题羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）检测法：进入细胞后不可逆地与氨基结合偶联到细胞蛋白质上，当细胞分裂时，CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞，其荧光强度是亲代的一半，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减。MTT检测法：线粒体内的脱氢酶可将黄色的MTT分解成紫色的水不溶性的甲瓒，并沉积在细胞中，死细胞无此功能，MTT结晶形成的量与细胞数和细胞活力呈正比CCK8：优点：a使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂b快速检测c灵敏度很高d重复性优于MTT法e细胞毒性小f检测试剂无需预制，即开即用。缺点：a价格比较贵bCCK8试剂为淡红色，与含酚红的培养基颜色相近，容易漏加或多加Ki67（增殖细胞核抗原）：核增殖标志物，无组织特异性，可靠、迅速反映增殖率24细胞凋亡检测技术：形态学检测：吉姆萨染色、瑞氏染色、Hoechst33342、Hoechst33258、DAPIAnnexinV：凋亡细胞磷脂酰丝氨酸外翻到细胞膜外，AnnexinV是一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白PI（碘化丙啶）染色：溴化乙锭的类似物，嵌入双链DNA后释放红色荧光，DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，能穿过破损的细胞膜而对核染色。DNAFragmentation：凋亡细胞DNA在核小体间发生有规律的断裂，出现180—200bp的DNA片段，坏死细胞DNA断裂为无特征的DNA片段，进行琼脂糖电泳可区分凋亡和坏死。TUNEL（脱氧核糖核酸酶介导的缺口末端标记法）：细胞凋亡染色体DNA双链或单链断裂产生大量的粘性3—OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3末端，从而进行凋亡细胞的检测。线粒体膜电位：亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强和减弱说明线粒体内膜电负性的增高和降低（荧光显微镜检测、FACS检测）细胞色素C释放：凋亡细胞中细胞色素C从线粒体向胞质释放（分别抽提线粒体组分和细胞质组分，用抗细胞色素C的抗体进行western-blot分析，可发现细胞色素C由线粒体向细胞质转位）Caspase活性：Caspase3正常以酶原形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段被激活，可经western-blot分析25组织工程：应用细胞生物学和工程学原理，将人体某部分的组织细胞种植和吸附在一种生物材料的支架上进行人工培养繁殖、扩增，然后移植到人体内所需要的部位，从而达到器官修复或再造的治疗目的的一种技术。26组织工程3个支柱：种子细胞、生长因子、生长支架。27组织构建主要有3种方式：体内构建：种子细胞与生物材料复合后，组织尚未完全形成时即植入体内，组织形成与生物材料降解在体内完成。体外构建：在体外模拟体内环境，应用生物反应器形成组织和器官。原位组织构建：单纯植入生物材料支架于体内组织缺损部位，依靠周围组织细胞迁移并粘附于生物材料支架，形成并再生组织，这种方式并非经典的组织工程概念。28干细胞的主要特征：圆形或椭圆形、较高的端粒酶活性、增殖缓慢（机体需要时进入分化）、稳定增殖（维持自身数目）29干细胞维持自稳性的机制：不对称分裂30胚胎干细胞：从胚胎着床前胚胎的内细胞团经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞，可以分化成任何一种组织类型的细胞。31胚胎干细胞的分离方法：免疫法、组织培养法、显微分离法32iPS细胞与ES细胞的异同：相同：表达相同的多能性marker、全基因组比对几乎相同、都可以培育出小鼠个体不同：定向分化能力有强弱33iPS细胞的优势：不用破坏胚胎，无伦理争议、不需卵细胞，来源广泛、无免疫排斥、可作为研究疾病的模型。34转染：将外源分子（DNA、RNA）导入真核细胞的技术。35转染的方法：磷酸钙共沉淀法、DEAE—葡聚糖法、脂质体转染法、纳米颗粒作为载体的转染、电穿孔法、显微注射法、病毒介导的转染。36转染方法优缺点比较：电穿孔法：优点：转染效率较高。缺点：需要昂贵的仪器，对细胞的损伤较大（需要更多的细胞和DNA）显微注射法：优点：转外源基因没有长度上的限制，目前已证明数百kbDNA片段均能成功。缺点：设备昂贵、操作技术需要长时间练习、每次只能注射有限的细胞、不适合大量转染细胞的需要。磷酸钙共沉淀法：优点：便宜、对某些细胞转染效率高。缺点：细胞有限制性、重复性不佳、微小pH改变会导致转染的失败DEAE—葡聚糖法：优点：简单、重复性比磷酸钙共沉淀法好、可转染贴壁细胞和悬浮细胞。缺点：浓度高时有一定细胞毒性、不适用于稳定转染、转染时要除掉血清。脂质体转染法：优点：适用于把DNA转入悬浮和贴壁培养细胞，可用于瞬转和稳转、转入效率高，比磷酸钙法高5—100倍、能够转染DNA和RNA、转染的稳定性好，可重复性高。缺点：价格较贵，不适合大批量转染、阳离子脂质体对细胞毒性较高，可能干扰细胞代谢。病毒介导的转染：腺病毒载体：优点：插入DNA片段较长、宿主范围广，可感染分裂细胞和非分裂细胞、对人致病性低、不整合到染色体上，无插入致突变性、能同时表达多个基因、与人类基因同源，蛋白产物能有效折叠和修饰、能有效进行增殖，滴度高，外源基因表达效率高、病毒颗粒稳定，易于浓缩和纯化。缺点：表达时间短，需反复刺激、具有免疫原性，可能刺激宿主。逆转录病毒载体：优点：能够整合到宿主细胞、产生假病毒。缺点：只能感染能够分裂的细胞、整合的时候会导致宿主基因组突变、有潜在致瘤性。慢病毒载体：优点：分裂细胞和非分裂细胞均能感染、能够整合到基因组、免疫原性弱缺点：整合时同样有可能导致宿主基因组突变。37转染效率检测方法：免疫荧光、流式、western、PCR38瞬时转染：外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不整合到细胞的染色体上。外源基因导入细胞1-2天后收获细胞进行检测和分析，一个宿主细胞可同时存在多个拷贝数，产生高水平的表达。39稳定转染：DNA整合到宿主细胞的染色体，外源DNA整合到染色体上的概率很小，大约1/104转染细胞能整合。通常需要一些选择性标记反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。40稳定转染常用的筛选药物：G418、zeocin、Puromycin41影响细胞转染的主要因素：细胞状态、血清、DNA质量、转染技术42同源重组：将外源基因转入受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导入基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换有缺陷的基因片段，达到修正缺陷基因的目的。43位点特异性重组：发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需要一段同源序列即特异性位点（又称附着点att）和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。44基因打靶技术：利用DNA同源重组的原理，在基因组中某一特定部位进行定点的基因重组，是研究基因功能的有效手段。包括基因敲除和基因敲入。45反义核苷酸技术：经人工合成和构建的反义表达载体表达的寡核苷酸片段，长度多为15-30个核苷酸，通过碱基互补配对原理，与目的基因DNA或mRNA结合。46锌指核酸酶技术：识别并结合指定的位点，高效且精确地切断靶DNA。随后细胞利用天然的DNA修复过程—同源定向修复或非同源末端连接来治愈靶DNA的断裂，就能够进行基因组编辑，包括基因修复、基因删除和定向的基因添加。（效率高、可构建knockout细胞、周期短、价格上没有优势）47TALEN（转录激活子样效应因子核酸酶）：一种人工核酸酶，是用于定向基因打靶的一种新技术，由转录激活子样效应因子和核酸酶构成。48TALEN基因敲除基本流程：a确定靶点bTAL靶点识别域的克隆构建c将TAL靶点识别域克隆入特定的真核表达载体以表达重组核酸酶d将重组真核表达质粒转入细胞e筛选突变体。49RNA干扰技术：细胞利用外源或内源小干扰RNA激发相关的酶复合物，对同源性mRNA进行切割、降解，从而在转录后水平阻断基因的表达。50RNA干扰现象的几个重要特征：转录后水平基因沉默机制、很高的特异性、只有dsRNA才能诱导产生、只有针对编码区的dsRNA才能产生有效和特异性的干扰、作用迅速、连续产生dsRNA才能有长期效应。51siRNA制备的方法：化学合成、体外转录、长片段dsRNAs经RNaseⅢ降解、siRNA表达载体在细胞中表达形成shRNAs、siRNA表达框架52siRNA转染细胞的方法：磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、DNA载体转染、电穿孔法、显微注射法、病毒介导的转染53siRNA效果检测：从mRNA和蛋白质两方面进行：mRNA：RT—PCR、实时定量PCR、Northern杂交蛋白质：Western杂交、ELISA、免疫荧光54siRNA应用：探索基因功能、基因治疗领域、整形外科领域、药物筛选55RNA干扰存在的问题：AsiRNA导入体内的效率低下，如何有效地将siRNA转入体内成为RNAi应用的最大障碍B体内RNA递送的靶向性C如何在目的基因的序列上选择21-23nt左右的序列作为si