药物体外对肿瘤细胞的作用

药物体外对肿瘤细胞生长抑制作用姓名：王英迪学号：13080011065专业年级：2013级药学上课时间：2016.5.12实验目的1、学习无菌操作技术、细胞计数方法。2、学习MTT实验方法。3、观察抗肿瘤药物体外对肿瘤细胞生长的抑制作用。4、了解抗肿瘤药物体外筛选方法。实验材料细胞株：K562（人红白血病细胞）药品及试剂：5-氟尿嘧啶（5-FU），MTT，1640培养基，胎牛血清，台盼蓝染色液器材：超净工作台、倒置相差显微镜、96孔细胞培养板、微量移液器、铝制饭盒、灭菌枪头、枪头盒、细胞计数板、盖玻片实验方法（一）细胞计数法：1）取酒精棉球清洁计数板和专用盖玻片，并用丝绸布或擦镜纸轻轻拭干。2）用胰酶消化分散贴壁细胞或直接收集悬浮细胞制成均匀分散的单细胞悬液，必要时应进行适当的稀释或浓缩。3）取细胞悬液与台盼蓝1:1混匀，染色3分钟，取20μl液体，沿计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液。加样量以充满不外溢为宜，也不要过少或出现气泡。4）计算细胞活力（%）=（活细胞数/细胞总数）×100%（二）药物体外对肿瘤细胞的影响（MTT法）1.接种细胞：收获对数生长期细胞，吹打成单细胞悬液，调整至合适浓度；接种入96孔板中，每孔90μl，8000个细胞。2.加药：将实验用药物用灭菌水2倍稀释，配成5个等比系列浓度的溶液。加入到96孔板中，每孔10μl，每个浓度5个平行孔，对照组加入10μl灭菌水。3.培养：将已加药物的96孔板放入CO2培养箱中，培养48-72h。4.检测：每孔加入20μlMTT（5mg/ml),培养箱中孵育4h，每孔加入100μl三联液溶解结晶，37℃孵育过夜，酶标仪测570nmOD值。结果1．细胞计数结果：表1.细胞计数结果N1N2N3N4活细胞数23253624总细胞数23273724/ml10775.210424372723N54总ml/107.210424362523N54活%3.97%100NN总活细胞活力2．药物体外对细胞生长的影响：表2.药物体外对细胞生长的影响组别浓度（μg/ml）OD（X±SD）抑制率（%）IC50(μg/ml)对照组——1.6312±0.16530130.6755-FU2000.6736±0.054458.70525-FU1000.9052±0.152044.50715-FU501.1288±0.242830.79945-FU251.1438±0.110329.87985-FU12.51.3530±0.087817.0549讨论1．细胞生长情况：对照组OD值为1.6312±0.1653，不在0.8-1.2左右的范围内，所以细胞生长不太正常，所以实验结果可能存在误差。2．药物体外对肿瘤细胞生长的影响：对照组的OD值为1.6312±0.1653；浓度为12.5μg/ml的5-氟尿嘧啶实验组OD值为1.3530±0.0878，抑制率为17.0549；浓度为25μg/ml的5-氟尿嘧啶实验组OD值为1.1438±0.1103，抑制率为29.8798；浓度为50μg/ml的5-氟尿嘧啶实验组OD值为1.1288±0.2428，抑制率为30.7994；浓度为100μg/ml的5-氟尿嘧啶实验组OD值为0.9052±0.1520，抑制率为44.5071；浓度为200μg/ml的5-氟尿嘧啶实验组OD值为0.6736±0.0544，抑制率为58.7052。以上数据显示，随着5-氟尿嘧啶浓度的增加，溶液OD值越小（即肿瘤细胞数量越少），肿瘤抑制率越高，说明5-氟尿嘧啶体外对肿瘤细胞有抑制作用，并且这种抑制作用具有剂量依赖性。结论5-氟尿嘧啶体外对K562细胞有抑制作用，且具有剂量依赖性，随着浓度增大，抑制增强。IC50为130.675μg/ml。思考题1.抗肿瘤药物分为哪几大类，优缺点是什么？根据药物的化学结构和来源可分为：1）烷化剂包括直接作用于DNA、破坏其结构和功能的药物。为广谱抗肿瘤药。优点：分裂旺盛的肿瘤细胞对该类药物特别敏感，其在体内与细胞的蛋白质和核酸相结合，使蛋白质和核酸失去正常生理活性，对癌细胞分裂抑制作用强。缺点：该类药物在抑制和毒害增生活跃的肿瘤细胞同时，对其他增生较快的正常细胞，如骨髓细胞、肠上皮细胞和毛发细胞等也产生抑制作用，会产生许多严重的副作用，如恶心、呕吐、骨髓抑制、脱发等。同时易产生耐药性而明显降低甚至失去治疗作用。2）抗代谢药物通过抑制DNA合成中所需的叶酸、嘌呤、嘧啶及嘧啶核苷酸途径，从而抑制肿瘤细胞的生存和复制所必须的代谢途径，导致肿瘤细胞死亡。抗瘤谱相对于烷化剂比较窄。优点：由于正常细胞与肿瘤细胞之间生长分数的差别，抗代谢药物能杀死肿瘤细胞而对正常细胞影响相对较小。缺点：虽然该类药物对正常细胞影响相对烷化剂较小，但其选择性较小，对增殖较快的正常组织如骨髓、消化道黏膜等也呈现一定毒性。3）抗肿瘤抗生素抗肿瘤抗生素是由微生物产生的具有抗肿瘤活性的化学物质。现已发现的抗肿瘤抗生素大多是直接作用于DNA或嵌入DNA，干扰其模板的功能，为细胞周期非特异性药物。优点：对S期细胞有很强的杀灭作用，对肿瘤的抑制作用强。缺点：对增殖较快的正常组织如骨髓、消化道黏膜呈现一定毒性。4）抗肿瘤植物药作用于微管，干扰细胞的有丝分裂过程。优点：疗效好，毒性较低。来自天然来源。缺点：对增殖较快的正常组织如骨髓、消化道黏膜呈现一定毒性，即具有骨髓抑制及胃肠道反应等副作用。部分药物具有心脏毒性和免疫功能抑制作用。2.你认为今后抗肿瘤药物的应用趋势是什么？①传统抗肿瘤药物虽然作用比较强，但是特异性较差，毒副作用较大，因此，它在今后的抗肿瘤药物市场中所占比列将会日益下降；②具有靶向功能的抗肿瘤药物在今后很长一段时间内将占据市场很大的份额；③在靶向抗肿瘤药物持续不断发展过程中，也会寻找MDR(多药耐药)逆转剂，由于MDR是导致肿瘤化疗失败的最重要原因，是肿瘤化疗的一大难点，因此寻找发展MDR逆转剂是非常必要的，或者加用两种或更多种抗肿瘤靶向药物可能会进一步提高传统细胞毒化疗方案的抗肿瘤效果。④抗肿瘤转移药物的研究。临床诊断的肿瘤患者大约有50%以上的已经发生了转移，而大部分患者最后都死于肿瘤转移，因此研究开发抗肿瘤转移药，如肿瘤转移多肽抑制剂、肿瘤细胞水解酶抑制剂也是必须的。⑤基因治疗。研究发现，人们可以通过导入野生型抑癌基因、自杀基因、抗耐药基因以及反义寡核苷酸、肿瘤基因工程瘤菌等来治疗癌症。基因治疗将会成为综合治疗恶性肿瘤的一种极为有效的方法，但还需进一步研究。