细胞工程期末总复习

细胞工程期末总复习一、无菌操作1、点燃酒精灯，所有操作均在火焰近处并经过烧灼进行；2、冷却后才能使用；3、操作时，打开试管盖，要进行烧灼灭菌，但是时间要短。在火焰上烧瓶口。保证容器倾斜。•4、进行操作时动作要准确敏捷，但是不宜太快，防止空气流动，增加污染的机会；•5、超净工作台上的器具和用品要摆放合理；•6、操作时器具不能触及瓶口以防止污染；•7、不要说话•接种时在近火焰处打开瓶口，使瓶倾斜，以免空气中微生物落入瓶中•整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速•防止操作带来的污染，接种过程中尽可能达到悬空要求•接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口•瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口•接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生二、细胞分裂指数指分裂期细胞在全部细胞中所占的百分率，用以表示细胞的增殖旺盛程度。一般要计算和观察1000个细胞中的细胞分裂相数。三、活体染色体外活体染色就是在体外条件下用某种染色剂（即活体染料）对活的组织或细胞进行染色，而不影响活细胞的生命活动的一种方法。利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，染色后的培养物还可以继续进行培养。四、密度抑制（densityinhibition）只要营养充分，接触抑制的细胞仍能分裂增殖。但细胞密度进一步加大、营养减少、代谢产物增多时，（因营养和代谢物的影响）细胞分裂停止，出现接触抑制。五、原代培养的分类1、组织块培养处死动物，无菌取组织块入小烧杯中，用尖嘴眼科剪刀将组织块剪碎，吸管吸取Hanks液冲下剪刀上的碎片，补加3-5mLHanks液，用吸管轻轻吹打，低速离心，弃去上清液，留下组织块。2、组织消化培养（1）取材、分离、消化消化软组织：0.25%胰蛋白酶消化纤维组织：0.1-0.3mg/ml胶原酶消化传代细胞（制成细胞悬液）：EDTA+胰蛋白酶(2)、培养：接种：接种量大小视情况而定；防污染；常规检查：1-2天做一次。六、贴壁培养的生长特性1、游离期：接种的细胞，悬浮，细质回缩变圆。2、吸附期：细胞类型不同，贴壁时间有差异。贴壁快：单个细胞，传代细胞；贴壁慢：组织块，较大细胞团；不利于细胞贴壁的：细胞状态不好，培养基pH不正常，培养瓶不洁。3、繁殖期：圆形悬浮细胞贴壁后延展成极性细胞，此时有细胞运动，无细胞分裂。经一段停滞，开始分裂。随着细胞数量的增多，开始接触并连接成片，这时细胞分裂及运动停止。4、退化期：细胞长满培养瓶壁达一定密度，随着营养物的消耗和代谢物的积累，细胞开始退化。七、细胞融合（又称体细胞杂交、细胞杂交）在离体条件下用人工方法将不同种或同种不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞,用于生产特殊生物制品、产生新物种或新品种的技术。细胞融合技术的出现标志着细胞工程的诞生。八、杂交瘤技术的基本原理（重难点）Burnet(1957)提出克隆选择理论：一种浆细胞只产生一种类型的免疫球蛋白分子，那么，从一个单克隆细胞产生的抗体分子就是单克隆的，且该单克隆抗体具有独特的均一结构。此假定经各种实验得以证实。传统的抗体制备（多抗）：没有通过细胞的克隆阶段，一群B淋巴细胞接受一种抗原分子刺激，分泌针对一种分子的多个抗原决定簇的抗体。将瘤细胞与B细胞融合，培养成既能产生单一抗体，又能在体外快速生长的杂交瘤细胞。该杂交瘤细胞群经单克隆化，持续分泌成分单一的针对一个决定簇的特异性抗体，称为单克隆抗体（mono-clonalantibody,MCAB）。骨髓瘤细胞（A）与淋巴细胞（B）融合的混合物中有五种细胞：没融合的两种细胞（A、B）、两种细胞的自我融合细胞（同核体）（AA、BB）、两种细胞互相融合的杂交瘤细胞（异核体）（AB）。1、亲本细胞的选择要求（1）骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞本身不分泌抗体（保障杂交瘤细胞产生单抗）；有无限分裂的能力；次黄嘌呤、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT－）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK－）——保证在HAT培养基中不能生存增殖。HAT培养基用于筛选具有次黄嘌呤（鸟嘌呤）磷酸核糖转移酶(H（G）PRT)或胸苷激酶(TK)活性缺陷细胞的培养基。HAT选择培养基的作用是筛选出（杂交瘤细胞）（2）B淋巴细胞：经特定抗原免疫能产生目的抗体的淋巴细胞，且被免疫动物种系与骨髓瘤细胞一致或相近亲缘关系。2、HAT培养基筛选杂交瘤的原理：为去除未融合的骨髓瘤细胞，在培养液中加次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶脱氧核苷（T）。A阻断正常细胞DNA合成主路途径（二氢叶酸到四氢叶酸），故只有能利用H和T的正常细胞从旁路合成DNA才不死亡。骨髓瘤细胞：（HGPRT－和TK－）无法利用旁路合成DNA，主路又被A阻断，故单纯的瘤细胞不久即死亡。B细胞：有最高分裂次数或不分裂，死亡。杂交瘤细胞：具有瘤细胞（无限分裂的能力）特性和野生型淋巴细胞（HGPRT+和TK+）旁路合成DNA的特性，长期生存，从而被分离出来。杂交瘤制备的过程1、亲本细胞的准备：1）脾淋巴细胞：处死小鼠、摘下脾脏，得到淋巴细胞2）骨髓瘤细胞：台盼蓝染液检查细胞活性，活细胞80%以上2、细胞杂交融合：按4:1~10:1的比例将脾细胞与骨髓瘤细胞混合，PEG促融（37℃），离心收集3、分装培养筛选：一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。培养5~6天有杂交瘤细胞克隆出现，未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞5~7天后逐渐死亡。4、抗体检测（1）抗原结合法：（2）第二抗体法：5、杂交瘤细胞的克隆（1）有限稀释法：（2）软琼脂法：九、胚胎移植（embryotransfer）也称受精卵移植，一头母畜（供体）发情排卵经配种后，在一定时间内从其生殖道（输卵管、子宫角）取出受精卵或胚胎，移植到另一头与供体同时发情排卵、但未经配种的母畜（受体）的相应部位（输卵管、子宫角）。经胚胎着床、生长发育，产下供体的后代。•供体：品质优良•受体：繁殖力好•原则：从何处取出移植到何处。十、胚胎移植的目的（意义）•1结合人工受精、冷冻精液：最大限度利用优良种公畜，加快家畜优良品种的推广速度。•2发挥优良母畜的繁殖潜力•3作为胚胎操作的基础•4保存遗传资源•5结合低温冷冻技术，可以不受时间、地点限制，把受精卵或胚胎进行长期保存和运输。十一、干细胞及其分类干细胞是指动物有机体在最初形成发育为完整个体的过程中，始终保留的部分未分化的原始细胞。具有分裂完成自我更新和分化形成新类型细胞的能力。按分化潜能大小分类：1.全能干细胞：具形成完整个体的分化潜能。如ES细胞2.多能干细胞：具分化出多种细胞组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力。如骨髓多能造血干细胞（分化出12种血细胞）。3.定向干细胞：或单(专)能干细胞、偏能干细胞。只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如表皮干细胞，肌肉干细胞等。十二、ES细胞和EG细胞的概念及异同点1.ES细胞（embryonicstemcell）：存在于早期胚胎的内细胞团的全能干细胞，是一种高度未分化的、与早期胚胎细胞的形态特征相似、有很强分化能力的细胞系。可无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，形成机体所有组织器官。目前，ES细胞的分离培养及定向诱导分化已成为干细胞工程领域的热点和难点。是转基因动物、组织工程、基因治疗、临床移植的细胞来源。2.EG细胞（embryonicgermcell）从早期胎儿生殖嵴原始生殖细胞(primodialgermcell)分离的多能性干细胞，称为EG细胞。(哺乳动物生殖嵴起源于中间中胚层，具有双向性发育的特点。)3.ES细胞与EG细胞的异同（1）相同点：1）各种动物的ES细胞直径12~15μm，EG细胞的15~18μm；2）EG细胞与ES细胞均具有高核质比率；3）表达较高水平的AKP活性和端粒酶活性；4)EG和ES细胞都表达Oct-4转录产物（维持细胞多能性的一个重要转录因子）；5)体外形成的类胚体都进一步分化为多种类型细胞：造血、心肌、神经和血管内皮细胞等。（2）差异：1)胰岛素样生长因子受体（1gf2r）甲基化状态不同；2)EG细胞：小鼠表达SSEA-1,而人类表达SSEA-3和高分子糖蛋白；3)小鼠ES细胞表达SSEA-1外，还表达起源因子（genesis）、生殖细胞核因子（germcellnuclearfactor）、生长分化因子3（GDF-3）；4)EG细胞与宿主胚胎嵌合时畸胎瘤的形成率要高些。SSEA:阶段特异性胚胎抗原十三、等密度沉降分离法据细胞密度差异分离细胞。细胞在连续密度梯度分离介质中，受强离心力的作用，最后达到与其密度相同的分离介质层面，并保持平衡。非连续密度梯度介质：细胞集中在介于自身密度的两种密度介质的交界面上。2胚胎干细胞核移植法•胚胎干细胞经（？）抑制分化培养——核移入去核卵母细胞中——胚胎——个体。•成功分离出干细胞的：小鼠、牛、猪、羊、兔等•克隆成功的：小鼠。未着床早期胚胎——显微手术——2、4、6等份——植入受体而妊娠产仔——遗传性能一样的个体。二等份成功的：小鼠、兔、山羊、绵羊、猪、马、牛等。四等份成功的：小鼠、绵羊、牛。六等份：小鼠。（算不上真正意义上的克隆，应是“多胞胎复制）1胚胎分割法十四、哺乳动物克隆技术十五、动物乳腺生物反应器乳腺生物反应器的原理：通过转基因动物的技术方法，将外源基因置于乳腺特异性调节序列之下，使之在乳腺中表达，然后通过回收乳汁获得重要价值的生物活性蛋白。应用：改良乳汁；生产药用蛋白。制备：构建载体→选择目的基因→体外重组→导入受体（全能性细胞）→胚胎发育与移植→产出个体、性状鉴定。十六、雌核发育核失活或消失的精子与正常卵子受精，仅由母体基因（卵子）形成（二倍体）胚胎发育为（二倍体)个体的现象。可自然发生和人工诱导。雌核发育的意义：（1）产生单性种群：（2）同源型二倍体克隆雄核发育（androgenesis）：二倍体雄核生殖的个体生存率很低：精子基因的纯合性、卵子的损伤、阻止第一次卵裂的损伤。意义：遗传学基础理论、育种应用、核质杂种、性别控制（yy雄性）十七、酵母人工染色体•1983年首次构建YAC(含染色体三要素和外源DNA，55kb)；•1987年构建并证明载体YAC：能克隆大片段人体DNA分子，可用于构建高等生物的完整基因组文库，载体容量提高10倍，达105-1010bp。在人类基因组计划研究中发挥了重要作用。构建过程：•1、大片段DNA的获取：提取染色体DNA、酶切、电泳、切割回收电泳条带。•2、YAC重组体的构建：提取YAC质粒、酶解、获取YAC载体左右臂（带选择标记）、与大片段DNA连接——YAC重组体。•3、YAC重组体对酵母的转化：•4、YAC基因库的鉴定：探针杂交、Southern转移•5、目的基因YAC克隆的筛选鉴定：PCR•6、目的基因YAC克隆的鉴定：探针——目的基因某段序列。十八、愈伤组织及脱分化愈伤组织：在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞（细胞排列疏松、无规则）。脱分化又称去分化：已经分化的植物器官、组织或细胞，当受到创伤或进行离体（也受到创伤）培养时，已停止分裂的细胞，又重新恢复分裂，细胞改变原有的分化状态，失去原有结构和功能，成为具有未分化特性的细胞。十九、思考讨论：为什么体内细胞没有表现出全能性，而是分化成为不同的组织、器官？基因在特定空间和时间条件下选择性表达的结果。在个体发育的不同时期，生物体不同部位的细胞表达的基因是不同的，合成的蛋白质也不一样，从而形成了不同的组织和器官。例1、在生物体内，细胞没有表现出全能性，而是分化为不同的组织、器官，是因为：A、细胞丧失了全能性B、基因的表达有选择性C、不同的细胞内基因不完全相同D、在个体发育的不同时期，细胞内的基因发生了变化B二十、植物组织培养：是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育的所有培养技术的总称，也称之为离体培养。具体就是：利用植物体的器官、组织或细胞，通过无菌操作接种于人工配制的培养基上，在一定的光照和温度条件下进行培养，使之生长发育的技术。练习：1、为何已分化的细胞仍具有发育成完整个体的潜能？离体、提供营养物质、