细胞死活鉴定

山东大学实验报告2015年3月30日姓名陈傲蕾系年级13级生科组别同组者科目细胞生物学实验题目细胞培养与细胞死活鉴定学号1【实验目的】1、回顾细胞培养的有关知识；2、学习小鼠脾细胞的分离技术及简单的细胞培养技术3、掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用；4、了解细胞原代培养的基本方法及操作过程；5、学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法；6、学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数；7、学习实验过程的详细描述及实验记录。【实验原理】细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。②代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧山东大学实验报告2015年3月30日姓名陈傲蕾系年级13级生科组别同组者科目细胞生物学实验题目细胞培养与细胞死活鉴定学号2光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。1.细胞原代培养原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。是用无菌的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体内进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。细胞培养的意义:具有其他生物技术无可比拟的优点培养条件易改变和控制便于单因子分析便于人们直接对细胞内结构、细胞生长及发育等过程的观察在生物学的各个领域如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等已被广泛应用。细胞培养的局限性在脱离机体复杂环境下细胞培养条件与躯体环境有一定距离观察到的结果有时难以正确反映机体内的状况细胞培养得到的产物少。2.染色法鉴别细胞死活细胞死活的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：死活细胞，细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。活细胞必须通过控制物质进出细胞膜来保持内部环境的稳定性，细胞死后，细胞膜的通透性发生改变，原先不能够进入细胞的物质也能够进入细胞。台盼蓝染料正常情况下被活细胞阻拦在细胞膜外，只有细胞受损或者死亡，才能进入细胞。因此，活细胞一般不能被台盼蓝染色，而死细胞会被染成蓝色。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。3.悬浮细胞计数（血细胞计数板法）用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的细胞计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽，构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为山东大学实验报告2015年3月30日姓名陈傲蕾系年级13级生科组别同组者科目细胞生物学实验题目细胞培养与细胞死活鉴定学号3计数室。血细胞计数板构造如图1。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格(图1)，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3（万分之一毫升）。计数时，通常数五个中方格的细胞总数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的细胞总数，然后再换算成1ml细胞悬中的细胞总数。图1血球计数板构造示意图25个中方格的计数板，设5个中方格中的细胞总数为A，细胞悬液稀释倍数为B，则：1mL细胞悬液中的细胞总数=A/5×25×104×B=50000A·B（个）。【实验材料】1.试剂：75%酒精、PBS液、细胞培养液、台盼蓝。2.器具：超净工作台、解剖盘、镊子、剪刀、吸管、移液枪、玻璃培养皿、塑料培养皿、“L”型针头注射器、火柴、酒精棉球、酒精灯、Eppendorf管、离心机、二氧化碳培养箱、记号笔、倒置显微镜、血细胞计数板、盖玻片、普通光学显微镜、玻璃离心管，等。3.材料：小白鼠山东大学实验报告2015年3月30日姓名陈傲蕾系年级13级生科组别同组者科目细胞生物学实验题目细胞培养与细胞死活鉴定学号4【实验步骤】小鼠脾细胞原代培养1.取材：取小白鼠一只，采用断头法处死；清水洗小鼠并浸于75%酒精中灭菌3min。取出转入超净洁净台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔。取出脾脏，去除其周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗1~2次。转入无菌玻璃培养皿中，待用。2.分离脾细胞：用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型针头注射器在皿中吸取PBS液0.2ml，然后将其沿脾长轴方向注射入脾内（使脾脏膨胀以利于细胞散开）。用针尖在脾脏上扎眼，并用“L”针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞，稍倾斜并静置1～2分钟。吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf管，并使量至1ml，以3000r/min，离心1~2分钟。3.培养脾细胞：超净洁净台中取塑料培养皿一个，用“枪（1ml）”加入细胞培养液2ml，并在皿盖上画上标记，待用。取上述离心后的Eppendorf管，在超净洁净台内开盖弃去上清液，用“枪（200μl）”吸取塑料皿中的培养液400ml加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ml脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37℃、5%CO2培养箱中培养。染色法鉴定细胞死活及活细胞计数1.试剂配制：用生理盐水配制0.4%台盼蓝染液，备用。2.细胞生长状态观察：从培养箱中取出培养物，观察培养液的颜色。然后将培养皿置于倒置相差显微镜观察细胞生长状况。3.细胞悬液制备：取0.5mL细胞悬浊液于试管（本实验中，用玻璃离心管代替）中，加1-2滴台盘蓝染液（约0.1ml），混合均匀，染色2min。4.细胞计数：滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，细胞悬液依毛细作用扩散到计数区，使悬液自然充满计数板小室（注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加）。在普通光镜10x物镜下找到中心处的大方格，改用40X物镜，取中间和四个角上的中等方格，计数每个方格内死活细胞的数量（注意：当遇到位于大格线上的细胞，一般数上不数下，数左不数右）。先计数总细胞，再计数死细胞（蓝色）。5.根据染色结果计算活细胞率：依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：山东大学实验报告2015年3月30日姓名陈傲蕾系年级13级生科组别同组者科目细胞生物学实验题目细胞培养与细胞死活鉴定学号5【实验结果】1.细胞原代培养形态观察图2倒置显微镜下细胞原代培养图示（10×40）原代培养后的培养液呈粉红色，上清液澄清，未出现异味，也未被污染。在倒置显微镜下，原代培养的细胞清晰可见，细胞多呈圆形，形状规则，细胞质均匀。2.细胞计数（自己原代培养1周的细胞）用血球计数板计数，分别计算了红细胞计数区域的五个小方格，计数结果如下:编号（中格）右上右下左上左下中总数/个157111211死细胞数/个12610128活细胞数/个31103细胞存活率=活细胞数/细胞总数×100%=（3+1+1+0+3）/（15+7+11+12+11）×100%=14.29%每毫升液体中细胞的数=[(15+7+11+12+11)/5]×25×104=2.8×106个/m山东大学实验报告2015年3月30日姓名陈傲蕾系年级13级生科组别同组者科目细胞生物学实验题目细胞培养与细胞死活鉴定学号6图3细胞计数结果（10×40）山东大学实验报告2015年3月30日姓名陈傲蕾系年级13级生科组别同组者科目细胞生物学实验题目细胞培养与细胞死活鉴定学号7【实验结果分析】本次实验中所测活细胞率为14.29%，比例略微偏低，分析可能有以下原因可能影响实验结果：a)在离心分离呈单细胞的过程中离心机转速过快或时间过长很可能会导致细胞破裂，导致小鼠脾细胞大量死亡；b)在无菌操作的过程中操作不规范，导致染菌，会影响观察，导致实验失败；c)取液时没有摇匀细胞液，导致所吸取的细胞悬液中细胞密度较低；d)染色时间过长，或观察时间过长都会导致染色试剂将细胞杀死，使细胞活力骤降，这是导致活细胞比例比较低的重要原因；e)实验中的一些不正确或不规范